关于含EDTA的胰酶的使用问题

amney1

0 c3 k2 \) `# I& U, E- i       请教各位前辈，文献里写如用含EDTA消化液，应先用HANKS液将消化液冲掉，再加培养基。那用含EDTA的胰酶消化全骨髓法培养的间充质干细胞时，具体应该怎样操作？# G9 p5 S. f& p/ e% ^) C
先加入HANKS液的话，消化下来的干细胞不是就随倒掉液体也一起被倒掉了吗？先加入HANKS液的话，消化下来的干细胞不是就随倒掉液体也一起被倒掉了吗？

Demon_CN

首先，我们用胰酶的目的是让贴壁的间充质干细胞从壁上脱落下来，
0 c: D% O5 J1 U# e9 L* q; L. X其次，加入EDTA的目的是螯合二价离子，提高酶的活性。; q2 E- j5 j0 W7 ]
然后，注意事项，消化前要用盐水冲洗两边，目的去掉参与的培养基，提高消化效率；消化完了要加培养基终止消化（原因是培养基中蛋白质多你懂的）。
: O6 s6 a( U7 l0 o9 h( d! a5 l最后，离心去上清（去掉胰酶什么的），得到细胞
1 |$ H1 {; |& ?) \, e7 {1 }) M所以不知道你加HANKS干嘛用的！

lxm5668

Demon_CN 说明的很清楚。HANKS也是一种缓冲液，与PBS的作用是类似的。

receiver1

我们不用Hanks液，都用PBS。
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; }+ t( H5 q; x# P, d8 M# C0 e吸掉培养基，PBS洗。加胰酶-EDTA消化后，培养基（含血清）终止消化，用PBS收集细胞到离心管，1000r，5min，细胞可以计数冻存或传代。
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或者加胰酶-EDTA后，快速混匀一下（让所有细胞都接触到胰酶），然后弃掉胰酶，细胞只与少量胰酶接触。轻拍，等细胞消化下来后，直接加培养基，可以继续培养或按比例传代。

qilan2012

溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，普通的HANKS液是含Ca2+、Mg2+的，所以用PBS或盐水冲洗培养基都比HANKS好吧。细胞间形成和维持紧密连接是需要Ca2+、Mg2+的，而EDTA的作用是螯合Ca2+、Mg2+，是用胰酶消化后脱离瓶壁的细胞进一步分散成单个细胞。用HANKS同样会对EDTA的作用造成影响。

jkfly

倒掉原来培养基，PBS洗，含有EDTA的胰酶消化，核固缩，细胞部分脱落，含血清培养基中和，离心，去上清，重悬。