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四叶草

新手上路

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楼主

发表于 2011-11-20 00:42 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

大家好，本人初次提问，希望有相关经验的好友给予帮助！谢谢！3 G: |7 W- ~1 v' b+ I; R. q
我想问：提取RNA再反转录成cDNA，在Real-time PCR中选择相对定量方法，制作标准曲线时，是用cDNA梯度稀释还是反转录前的RNA梯度稀释？哪个效果会比较好？

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zerollx

版主

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沙发

发表于 2011-11-20 18:50 |只看该作者

以RNA为模板是P不出来产物的，若有条带，那说明你提的产物有基因组污染，是不能做后期分析的，除非你用的反转录试剂盒里含Dnase那就另说了，这就是RT中的No RT control。标准的做法是以cDNA为模板做标曲，因为其可以更真实的反映模板的扩增环境。但是这样做会消耗大量的cDNA，这就意味着你需要制备大量的样品，会非常麻烦。一般我们会选择以cDNA为模板，用你的待测和内参基因分别做2次普通PCR再纯化，以收集大量的纯化片段，再以此为模板做标准曲线。