u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24 - ^" M) Q! K% J3 a
回复 hughliang 的帖子* i" O0 ^  f$ o$ m+ l! s: D
6 \! k8 Z2 m$ V8 Y& T- y
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

8 p& _! u8 x9 R* m$ n' H是有这个可能。
7 i; ^) V1 E* `  D5 A" S. w) H" A. G2 M: l7 o* k- o" P
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
1 b/ [. w+ `8 h回复 hughliang 的帖子
3 P+ b2 ?- ]) e9 u6 }! Y2 b9 g9 u/ U( {$ u5 c% Z8 w
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

: k( u8 y* D8 U1 m; a' c% e
不客气
( K  |" E1 @! r0 g/ g) x4 ?9 A) z3 k+ I( p7 ?% S3 b
也分享两篇供参考1 K/ x! ]& g! j  N5 k* }0 z* m
  m" }) [* j- g' G# B) o" W
祝实验顺利
0 h3 [6 x: R2 E2 v+ g% I% x4 y' M, w: X4 i7 z

fguw

回复 hughliang 的帖子
- l/ c. _; A& u  V/ D
' S: {0 L- W5 d& M2 Y7 {我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
; {& H# i6 n( ^2 k( j, M$ F流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？) ~8 |4 [2 ]% L
如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
& ^% f$ _0 @% v# Q4 T/ T* I0 r还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子" _- l, Z7 J" P
7 d  u% ?7 \: j$ z' Y6 U1 P4 {
是的，偷懒没挑单克隆。/ @4 ?" m5 Y3 o

3 T" P" m$ Z0 O  k1 y" ~! k我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
) B, [' U2 `/ x# ^( e1 |3 S& [1 W- t
流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。
/ p) o8 B( g5 {( S. P+ A
: v  R  T- b0 j# l) C! d) G. q谢谢！

sarah19860420

回复 runsong 的帖子
$ b8 i9 O% W4 g. ~0 H. d' q
! I) k# A' S1 [3 h  N您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT! R- M" n8 d$ _! Z  }
reverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C3 t0 \" M1 o' {: ]2 w  C( P5 T

, G1 x  i' C/ i3 h( Q我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神