MSC诱导分化专题

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胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化) h0 l  _$ Y/ g! C7 U9 K
1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。: g+ k/ `7 Q; G+ q/ B: k( ~
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。1 Z* O2 W" a( N9 V- ~8 z
3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：
* V) V! R; O6 I% b一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；3 B1 D% Y/ T  @5 Z( e
二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。; N% V; c4 Z& M% u( C" @
37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。$ a- M) [3 z5 Y4 S! X9 S; d
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。0 G$ K  Y: i6 @6 C1 J
5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。
! t0 u) |. e- K" S+ H0 i) G. U  r. S3 S6 P9 E
参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.
/ F5 }. _1 {0 \" UBiochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

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* G) s! f" _; Z, v% c! {! l/ i我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：3 t; v" Y/ t! u6 [* |
Osteogenic differentiation.+ c5 j4 B* C% ]* P1 o
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.
; ^1 _8 D) \. ZAdipogenic differentiation.5 m, R* L# @- d0 N' G
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.
# y* J- C/ F8 Z3 ~- e  G1 Pendothelial differentiation of ADAS cells.  A0 F: a9 L, y0 I8 _
To analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

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MSCs向神经细胞的定向诱导分化
% W, H& _: r$ h; cMSCs向神经细胞的定向诱导分化3 g/ s- K2 l: N+ z
! q! p+ U! q/ k7 B
一 MSCs的培养和纯化
$ _: Q8 i2 y4 O4 a1 U二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化
7 B2 o. X) A  X* @' i8 `! Q传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。
  g+ N! W! l/ G! x% R三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定
, V* q/ E1 h8 \! U. Y* ~( [/ H/ m免疫荧光法详细步骤如下
- }3 y- L& ~- L' i2 O①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;
9 o# [5 a% F0 I②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
& I2 g5 W" r: I  i: W& q+ L% B, w③用0.4%Trixton-100透化15min。2 P' M7 u$ K& j" |3 D
④10%BSA封闭1小时。  c2 b7 R) Y% _6 A9 \
⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。
5 g$ f) R: c) H; r, e; r# v⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。
1 Y$ F5 U4 S* H  c⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。! m( N* v4 J" Z0 {* P! B
⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

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贡献一下我的向造血分化的培养体系：' P. f2 p' p) H, F
造血干细胞的诱导培养
* I) l9 H$ P0 ^) R# j- c试剂：$ i; M" \1 G5 b( O+ N6 ^( T0 T  ]
1.  淋巴细胞分离液
! Y! f) h2 v5 d7 z; F. g9 ^NaCl  4g
: m: \1 w+ e1 L4 j2 kKCl  0.1g
  g6 F, w$ O4 [. L# rKH2PO4  0.1g* }3 c3 x4 P; Q! \
Na2HPO4-12H2O  1.425g
6 d# k- U( d  [) e: K6 @2.  PBS 500ml+ p. k; s; V: P! ~& n7 n  ~! W
' ?- [$ ]( Q& Q* d% {+ C/ Q( W$ k3 S* Y
3.  进口胎牛血清
  N" A4 t7 p+ e) I1 H4.  IMDM培养基
3 e( T$ m3 n1 k( Y, x) a( T5.  2.7％甲基纤维素
' X4 K( `' x3 J: S+ d# J  配制方法一5 [  S1 ^# d  W; O' V' O, K/ R
1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。
, j: i( w; n' f8 t1 ~2 n& s2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。
) E) e* e( E7 h/ Z* ]$ J3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。
5 U8 a( K2 T1 v& J( W4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。
3 c$ T; B3 K. S8 h4 X! r  y' I, s) |5)加双倍浓度培养液125ml。
1 d: F( J' r$ M& i* i6)加10％NaHC03若干调节pH至7
# t' I! `9 [; k: u0 b7)分装若干小瓶备用。( s3 o. S1 P) O- m
  配制方法二（多选此方法）
2 i* P! p% p$ S$ K5 @( c0 }1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。: ^2 j/ o5 b* a$ C. y$ K( R
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。& j6 O0 l/ [/ X4 g: E4 }9 M3 K
3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。" H0 j7 @; Y1 |! m4 u' j; k& b
4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。
7 y; C) w" T' n% v+ K5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。
) h5 `% l+ {. `+ r6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。
2 Z7 t: b2 E" u  f6.  牛血清白蛋白组份V
4 T4 P$ P- ?8 p6 ^3 Y6 w牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。
4 K2 Y1 n% m+ Z: z! r(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。
$ M& Q; |; U. Y' I/ r/ q(2)配制步骤
# q/ q2 {& g0 `/ k# Y. J5 C1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。' X1 h9 C# p  Y" {
2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。$ A  j* Z3 l5 q0 Z! L8 E
3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。- Y9 `- ^: z+ v+ M( O7 ?7 }4 l+ M
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。
6 ^4 Z9 `8 f' z0 n5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。/ j- n0 X. o5 G; t1 T
7.  β－巯基乙醇：1000×) F0 I$ G, O+ a- {0 N; s
8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml% n! Y( h3 J* ?) _
9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln
7 z% }7 v, l% A1 E  J' P3 ^8 k; ~10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml% F4 h- Q! }1 Q# \; }+ y2 C5 m
10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃8 w, s" i9 l  z
11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）( O' d9 j4 g* G9 m  Q* c$ l# \
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml% \9 M  A' D) ~+ B- \3 @
13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml9 C! b) ~; h+ V4 Z0 C# \
14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml: B3 n& q" I# n4 ~
$ q2 c$ w% G3 ~, c  A
细胞因子的配制/ ?9 ]( y2 ~" \) Q' t8 Z
- |3 f- `* D- j; _8 J8 c
细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度6 q# T  ~8 H5 q. w
IL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml9 J8 S; i+ F+ \0 ]& t# t' [; |. J
IL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml5 D( j6 J4 \, j8 t4 b7 W* `1 n$ h
SCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml/ p# p" c7 L! s9 u& r! \5 B; Y
EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
* q/ Z* R" R' @- o" x" JG-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml8 ]" W" D* B( I7 f  Y3 n. d( J+ {* r
2 ^+ x) t2 I4 c4 ?+ u
IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度
2 X" T/ f; b5 O6 O3 x/ r, y9 l- H  Q+ g+ {) S- y. R1 r
IMDM培养基  30％
0 r+ ~' ^8 f5 {* n& v5 u! j进口胎牛血清  30％
& q8 h! K1 Y% ~. b甲基纤维素  0.81％8 c# M* b) I( x- J
牛血清白蛋白组份V  1％
' o6 i6 l6 u6 e  z# ~* Dβ－巯基乙醇  0.1mM
7 n& A* d/ Y' ?' W青霉素  60mg/ml
+ I  d, }# g( D3 w链霉素  100mg/l$ ]9 n3 v; z9 R0 o
IL-3  2ng/ml" Z: Y" k2 ~, H) g: l, g* v
IL-6  20ng/ml
. \+ d' D: }! q/ @0 ?. b6 j; ]! L6 `SCF  100 ng/ml7 d+ R0 l: h7 i7 o/ Q6 r& y8 j) ~
EPO  2U/ml" q6 ?- x- C; ?
G-CSF  10ng/ml
: [1 F2 y, L: e4 I& ]3 [# N. NGln  2mM3 g" I; A' K. Q! p
8 S  o8 q" L9 r; F4 C. y2 v9 ~# e
诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）+ p$ s; H) ?6 d

8 z; x! X$ m! ~/ p5 t向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导
' ^4 t" \% ~# ~# w2 X" VIMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml8 t& C  l% e1 Z* {
进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml1 h- f# ~8 z0 Z# g! ?
10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml
( v  |! K3 I- @) K& k; g1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl
5 \* f% E/ v0 PIL-3  5μl  5μl  5μl
1 q# s% e; e/ I; o5 Y% j* w3 W6 DSCF  5μl  5μl  5μl
& J9 d! I9 T' ]( H' q1 Y- NEPO   20μl     8 `5 n4 Q2 o: h/ T- g3 k
IL-6     5μl  ! y* o+ W+ ^8 S8 J
G-CSF        5μl
/ Y6 l  c" p' U) ^: ^100×Gln  50μl  50μl  50μl# \' P; P+ ?3 M, K
500×双抗  10μl  10μl  10μl6 U; E& w' T1 |7 K
2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

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骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养0 y( e5 z& P8 F7 S
1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以# S8 W, g9 u" {8 x" y3 [
10 5／ml接种传代。  X) |( U/ L5 `9 B7 ^0 F
2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

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成肌诱导  B6 k- ^8 K, x- g2 X2 ]5 A
2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。' p: F1 M: T# R& v

! Q: }  c; W: D9 G' M" X; W内皮诱导: J7 m4 b7 g6 c9 g1 ~
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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脐血干细胞向软骨细胞诱导分化
8 L- W! S/ Y1 ?  Z1 a6 n) x选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。
4 N8 _) o  t0 f& ~0 H8 `) p不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

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羊水来源干细胞诱导分化7 A; n3 R; v* u  a; Q
1、羊水来源间充质干细胞
+ e- X2 \) u( q6 i3 f地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞5 h# m8 o5 O( N& E
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞
( O2 I0 ?$ K; [8 _$ j5 `成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞
) d; a+ Q8 b+ q0 q: p: d7 n* \, i* W& F: b
2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）
8 j$ E' N( Y9 s% `地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞0 Q: u  Q5 U! t
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
5 {! Q) p6 H3 ^- G% x: z地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞
# w* H7 }' [, }* ebFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。) D1 c2 Z4 a" C8 J$ S

. U) E4 Q6 o/ R; m5 Y3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells! M6 G, [" x4 R" w9 t1 C
地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
  j% W( M4 l) V* R' y4 X9 q0 x+ v地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞$ x9 R7 ]3 u% u; }. j6 o2 v7 c0 K' F
5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞
0 R" l- `5 M+ z, S2 W  q! b' D内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞
' O* ]# v/ n9 x3 e  F0 H% D0 X( J% z二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
2 h# ?) B$ a+ M# z' F- t二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞
9 ~- w* ]% n5 U) @* [) C3 o
  J* b/ H! I4 {8 ^& e* Q& d参考文献：- R# Q- @/ ?1 e6 }3 Q
1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.
9 o: L6 ?  t9 [5 B& T: `0 o2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.) F0 E' ?) l; q7 [! c; X3 g! J
3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

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dfe77 战友辛苦了，这些很有用。9 E) u1 R3 k+ k0 N

( O1 r7 Y3 S1 E4 e( }如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

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