人ES细胞用悬滴法形成EB，形成的EB状态老是不好~~~

ielisa

培养的人ES细胞，传代时收集细胞，做成悬滴，30微升每滴，在培养皿盖内表面悬滴培养两天后再悬浮培养，已经做过两次了，可是形成的EB状态一直都不好~~就可以说完全没有形成EB，克隆松散，形状不规则，并且颜色也是灰色那种，根本不是亮黑色~这是怎么回事啊？我做的悬滴太小？悬滴的48小时内部营养已经消耗殆尽了？还是我做悬滴时把细胞打的太散了？抑或是细胞状态本身的问题？求各位大侠给指点迷津一下啊！！！！实在是很着急啊！！！哪位大侠有ES形成EB比较好的protocol能否共享下啊？实在是非常感谢了！

小禾禾

回复 ielisa 的帖子& p1 R% g  r: N2 x8 j

6 p" ]& r- G8 T$ {你使用什么酶消化的？消化时间是多少？做人ES的EB，一般不用悬滴法，常采用低吸附的培养皿悬浮培养即可。

细胞-77

有图吗？能否上传几张图来看看，图才能够直观的反应你的问题。可能是你的操作中的细节没有注意好吧。
$ V( a' m" f; Z8 R. w' Z+ b

sunny1987324

我也遇到相同的问题，只不过我培养的是小鼠的ES.希望高人指点。

ielisa

回复 小禾禾 的帖子- _8 v5 v$ Z8 e5 ?$ n) l

- G) @  u9 J' X1 Q胶原酶消化大概45min，我们实验室倒是有那种培养皿，我是看文献说悬滴法形成EB质量好，效率高才用悬滴法的，下次我试试不用悬滴法吧

ielisa

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  w, _# z! E5 n- s$ Z8 j0 P7 P) d3 [2 A  m( y- b. e
这次的没拍照，形成的EB要么就是很小很散，要么就是完全散掉了，没有成行，请问你有好的protocol没有？或者操作过程应该注意哪些细节呢？

小禾禾

回复 ielisa 的帖子3 W# F* |( z# g1 N$ S! G  k
5 p0 P0 r. B' K9 g$ H% J
胶原酶几？然后消化时间太长了。。几分钟就可以了。一般小鼠ES采用悬滴，而人的不是

ielisa

回复 小禾禾 的帖子
2 v0 y  q) l1 f: H4 x
& T# S8 u1 G, GIV，恩，好，我下次试验一定注意下

BDFCM

回复 ielisa 的帖子! J0 \0 X% d* D3 z! r9 c/ r
1 x* V. q' K% @0 ?/ L/ F
人胚胎干细胞单细胞悬滴法是不可行的，小鼠的ES用悬滴法是比较合适的。
$ N8 Z' b+ a1 a5 y* A; R人的ES通常是类似传代的消化，只是划线之后，把clusters转到低贴附的培养板里，悬浮培养形成EB。
2 E  Z% ]- T! }, E你可以试试

sdjnkx

胶原酶的浓度，或者消化时间