荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

  T' i# M( j1 Z7 M4 b4 R
  {6 V( r# _8 M1 L最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？' `5 w; V, P: e8 [- ^  C

$ H& X7 i+ \. d  \3 @! W看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
* V4 S' D- p3 J% H5 a不知道是否有探针数据库可以查询？( Z% D( ]- W. R% v

5 x% `. n! w( |+ p( y4 ~自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
, q1 u5 b+ D3 I6 t3 M( C$ V4 |% }" S; k
求高人指导~/ g" n& ~2 D6 ~( n9 D; w

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子
' D) w! a. w. `( O' {6 |1 R- Y- i; c3 U$ N  U
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

+ G2 a, ]+ [' B$ E, b0 ]% V7 a, U0 O0 s" s- M* g0 K; i
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。8 `/ e- z. p% U1 }! C& V) d
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
! `5 A* v- K- A4 i$ s* D! i- K$ ~上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。0 ]7 c4 E/ n  m1 m% U. F
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子; R0 r& g' i+ \* i1 A+ x

1 U4 c1 `  B+ T2 n* m$ j果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 - M  d0 `: A9 X# E
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

! C9 R1 W% ?: s
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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- n+ N6 [/ y8 b9 ?4 |$ |& U6 e4 p+ n: Y( }- m
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
  P# b4 K4 }4 I% p. x$ g, ZTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
. ?1 p2 F( I, U& U% U几点注意：6 ^' P; ?. b& l
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。4 ]  ?2 Q3 A# ?3 x* y7 Q3 d  [
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。( f6 b' f" ^$ g3 f
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
; g% P9 z% J( g; A1 i: F4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。
' Y6 O0 r% f% ^2 d) s

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子5 `! R% T/ Z, z5 t  H0 S, @9 W
% v0 b) B6 Z) |
第一次已经失败了啊，唉，呵呵