脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？

mengnancy

脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起，分离液对细胞有损伤吗？

大少爷

你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起”，现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。, [+ w' D4 W, G' y' u
我们的分离方法：
' \3 R+ `3 O4 o% p/ Z! b  O* @将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1：2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要)，慢升慢降。离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。
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诱导CIK，细胞增殖缓慢，培养基的类型，添加的因子量很关键。不知你是怎么做的？
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我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的，比成人外周血效果好得多。

mengnancy

感谢大少爷的回复。1 J% X$ ?& T0 \
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！$ a; Z( T+ |. w

mengnancy

感谢大少爷的回复。1 U6 x# T- R5 D* L
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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mengnancy

感谢大少爷的回复。, ?. L# J" P. r$ X" W0 Q- j6 O
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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细胞海洋

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感谢大少爷的回复。8 Z4 k4 Q/ w! |; _, n# I
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！& f1 Y1 N6 c' a5 g* A7 f
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大少爷 看前面

细胞海洋

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+ }0 {* R; l0 G( y
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样
6 Y  |5 r/ g! o, I9 ]! T/ K! @5 M否则 他会可能不到你的提问

大少爷

不知你的FICOLL是什么牌子，你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次，去掉一些红细胞和血小板等杂质，离心力300g左右。5 L) Z) y# _$ c3 G9 b9 v, _8 |- ~
用Ficoll液分离PBMC，洗涤两次，计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL，当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃，5% CO2悬浮培养，24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2，，每隔2~3d换液一次，前期细胞状态不好可以半量换液，状态好的话等量加液。第三次加液前先计数，然后按照1-2x106/mL加培养基。0 W3 {& O4 F! k  @. A9 o
CIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降，第七天左右会急速增加。所以不要着急，先养着看看。
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前几天换液，如皋状态不好，是吸取一半培养基，离心，换新培养基重悬细胞，按照总培养基量加因子。

hwlightning

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" y, q! o% B* i% n
$ I' `* E9 [( U请问下，你们用脐带血诱导cik，对血液除了传染病学检查还需要做哪些？

mengnancy

回复 hwlightning 的帖子) L- S  A8 M4 Q) `# v1 f" D

; e$ |9 N" Q& l. O. P对脐带血只做了传染病学检查，包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验，所以其他的没有做了。