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作者：刘海亮 窦科峰 李韧 李霄 张福琴作者单位：第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 710033
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% o) B/ \; k* s. @, B 【摘要】 目的：通过检测端粒酶活性（TMA）在原代大鼠边缘群及非边缘群肝细胞中表达差异，探讨边缘群细胞是否具有肝脏干细胞的部分特征. 方法：原位两步胶原酶法分离大鼠肝细胞. 应用流式荧光激活细胞分选术(FACS)将肝细胞分成边缘群（SP）及非边缘群(NonSP)，并定量分析两群细胞中TMA水平. 结果：存在SP细胞并占细胞总体2.1%，SP细胞TMA高于NonSP细胞（28.1±1.3 vs 2.0±0.2 TPG，P( `$ H# e/ l# r/ g
【关键词】肝细胞 大鼠 边缘群 端粒酶 干细胞
' A. a" A% s6 K6 R. K5 ? 0引言( @; y. Q! n1 G7 ?/ ~
1 x b& b" c( {4 a( `5 b; v干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞. 端粒酶活性在多数正常体细胞中不表达，而在胚胎细胞、造血干细胞、精原细胞中有表达. 我们利用流式荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)对原代大鼠肝细胞进行检测，试验是否也可以将正常大鼠肝细胞分成对荧光染料具有不同排出特性的边缘群(side population, SP)和非边缘群，并检测端粒酶活性(telomerase activity, TMA)的表达差异，以探索边缘群肝细胞是否具有更强的自我更新能力这一干细胞特性.1 Y' u' t" B/ u% X4 x+ ]5 n
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1材料和方法2 P# A3 u2 f+ C g0 a2 P+ k; I* o
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1.1材料雄性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心)、IV型胶原酶(Invirtrogen)、胎牛血清(杭州四季青)、HEPES、Hoechst33342 (Sigma). TRAPeze XL端粒酶检测试剂盒(Chemicon). FACS Advantage II型六色荧光流式细胞仪（BD公司）, BX51免疫荧光显微镜（Olympus公司）, PCR扩增仪(Eppendof公司), RF5000荧光分光光度计（日本岛津）, EPS 2Z200垂直电泳仪(Amersham)，其余试剂均为国产分析纯.
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# V0 X& D- E# M( u1 _1 a8 _) {1.2方法
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1.2.1大鼠肝细胞分离按Dunn等［1］法并略加改进. 雄性SD大鼠5只，体质量180~200 g，用20 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定、消毒，股静脉注射肝素1000 U，开腹显露门静脉后在距肝门1 cm处插入22G套管针，连接蠕动泵，以30 mL/min速率灌入4℃预冷的前灌注液(含0.2 g/L EDTA, 15 mmol/L HEPES的HBSS)，剪开下腔静脉放出血液，10 min后换为38℃预热的后灌注液（含5 mmol/L Ca2 , 15 mmol/L HEPES, 0.5 g/L Ⅳ型胶原酶的HBSS），以15 mL/min灌注10 min. 将肝脏取下放入12 cm培养皿中，加入4℃的HBSS，冰上操作去除肝包膜，钝性撕裂肝组织. 两层纱布过滤，将细胞悬液在4℃下50 g离心3 min，弃上清，重复洗涤2次. 4 g/L台盼蓝拒染法计算肝细胞存活率. 将肝细胞沉淀重悬于含100 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰岛素、100 nmol/L地塞米松、105 U/L青霉素、100 μg/L链霉素的培养液中，以1108个/L密度接种3个25 mL培养瓶，24 h换液，计算肝细胞贴壁率.
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1.2.2SP细胞及NonSP细胞的检测及分选①细胞染色：调整肝细胞悬液密度为1109个/L. HBSS洗涤，制备成单细胞悬液. 等分细胞悬液，两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 mg/L，其中一组再加入维拉帕米，终浓度5 mmol/L. 37℃避光水浴90 min，冰上10 min终止染色，冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮. 再加入PI使终浓度为2 mg/L. ②流式细胞仪检测：355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及NonSP细胞.
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: l3 d9 D: v; R: ~9 f3 y. F4 x1.2.3SP细胞及NonSP细胞端粒酶活性检测①细胞处理及PCR：取SP和NonSP细胞各105个，依照TRAPeze XL端粒酶检测试剂盒说明书进行细胞处理. PCR反应条件：30℃孵育30 min，94℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 1 min进行36个循环，72℃ 3 min延伸，然后是55℃ 25 min，终止于4℃. ②荧光分光光度计检测及数据统计：设置荧光素的激发/发射波长为495 nm/516 nm，硫氰酸盐的激发/发射波长为600 nm/620 nm，分别记录每个样本在两种激发/发射波长下的荧光值，并根据试剂盒要求计算出每个样本的TMA值. ③100 mL/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取20 μL PCR产物在垂直电泳仪中以200 V电压电泳1.5~2 h. 在凝胶成像仪上观察照相.9 C4 `3 `' p; W+ I6 U" @# b+ | J
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统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS 10.0统计软件包采用t检验对数据进行分析，P f c+ L+ K) x k2 a
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2结果+ R1 D. u8 U* n& H" F9 a* F4 e
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2.1肝细胞的分离平均每克大鼠肝脏可以获得(1.8±0.3)107个肝细胞，肝细胞存活率为(82±6)%. 接种24 h细胞贴壁率为(67±7)%.
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% i* R7 S5 o3 F! E0 \$ ?0 k2.2SP细胞及NonSP细胞的检测及分选前向散射和侧向散射二维参数图结果证明无PI染色细胞，无杂细胞干扰. 二维散点图中Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴，在细胞集中区域(P4)左下角(P3)另有小部分散点聚集（低Hoechst），而维拉帕米拮抗组无此区域，即SP细胞. SP占受检细胞的(2.1±0.2)%(图1)., }- t3 d0 u* j0 U: B& u0 K
" M7 n2 J5 @ q" j2.3SP细胞及NonSP细胞TMA检测①定量检测：SP细胞TMA为(28.1±1.3) TPG，NonSP细胞TMA为(2.0±0.2) TPG. SP细胞TMA水平显著高于NonSP细胞（t=50.440，P' @- X- @5 @2 K' Q# [0 Z" R
2 n2 c0 j/ \9 j3 u7 ]# h3讨论 ]3 Q. ?. j( y Q x* g; [
1 K* i3 o+ l/ ?7 f9 |; |! w干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，多种干细胞均表现出较强的端粒酶活性［2］，而端粒酶对于维持干细胞的自我更新、多向分化潜能以及抗衰老均有重要意义［3］. 近年来研究发现，一些细胞对DNA结合染料Hoechst33342有特异性排出，结合FACS分析，可得到低荧光并表现为边缘性聚集的SP细胞，这已成为一种经典的分离造血干/祖细胞的方法［4-5］，并在小鼠肺、皮肤、骨骼肌、乳腺、胰岛细胞及人类皮肤、角膜等组织的干细胞的分离中被成功应用［6］. 但SP细胞的干/祖细胞特征及其与已知各组织器官干/祖细胞的相互关系的鉴定仍在广泛研究中. 肝脏干细胞与SP细胞的相互关系研究国外已有报道［7-8］. Shimano等［7］通过对ATP结合盒转运蛋白ABCG2/BRCP1的检测研究表明，2乙酰氨基芴/部分肝切除(2acetylaminofluorene/partial hepatectomy, AAF/PH)模型的大鼠肝脏中，不但肝卵圆细胞中含有SP细胞，而且SP细胞数量同卵圆细胞数量呈正相关，在肝切除术后第7日，卵圆细胞和SP细胞均达到含量最高峰，并提出ABCG2/BRCP1这个SP细胞的重要表型可以作为分离卵圆细胞的一个有用标志. 我们用FACS法也分离得到了具有不同荧光特性的大鼠肝脏SP和NonSP细胞，SP细胞只占细胞总量的2.1%，与Wulf 等［8］分离小鼠正常肝细胞边缘群的结果(1%)相近. 虽然肝卵圆细胞已被广泛认为是肝脏干细胞样细胞之一，但卵圆细胞的分离纯化步骤复杂，多需要先建立AAF/PH模型活化卵圆细胞. SP细胞的分离方法相对简单，可以分离包括肝脏在内的多种器官特异性的干细胞/祖细胞，但缺点是需要具有紫外激发装置的流式细胞仪，成本较高.8 c! }9 l1 B; U4 ]: U: O: i+ m
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Wulf 等［8］的研究已表明小鼠肝SP细胞具有双向分化为肝细胞和胆管上皮细胞的能力，本实验中SP细胞的TMA水平显著高于NonSP细胞，从干细胞的自我更新角度提示SP细胞比NonSP细胞具有更强的自我更新能力和抗衰老能力，进一步验证了SP细胞的干细胞特征.% H# e0 G6 t% f3 |, g
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