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farui

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发表于 2015-8-14 18:14 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

RNA-sequencing数据处理流程9 L2 v3 p# z2 Q0 |, Y

RNA-sequencing技术已经逐渐取代microarray技术，成为转录组研究中的重要的高通量技术。我以前作了若干年microarray基因表达数据分析，也就是最近才开始作RNA-sequencing数据分析，现在把我了解的RNA-sequencing数据分析的流程写下来，一方面是给我自己增加印象，而且如果有错误的话希望得到大家的指正，另一方面是希望能对也使用RNA-sequencing技术的朋友有一些启发作用。

因为目前RNA-sequencing处理流程的每个环节上都有不止一种方法，这里我着重叙述我使用的方法，对于其他的方法我只能提及，但无法一一详述。另一方面，我这里处理流程从原始sra文件开始，到形成表达数据计数矩阵（count matrix）为止，所以严格说，这篇应该叫RNA-sequencing数据“预”处理流程。之后的differential expression分析，聚类分析，GO term分析，binding site分析以及pathway分析，在此我也不作详述，如果有朋友感兴趣，我可以在未来一一介绍。8 B& j2 I* m  Y+ l
: W, l- U2 G* T, F) k2 v
RNA-sequencing处理流程和microarray处理流程在“预”处理阶段差异较大，而在后续的处理差异较小（仅differential expression分析有差别）。RNA-sequencing“预”处理主要分四个步骤
第一步：下载.sra文件。在Bioconductor的SRAdb包里有方法可以下载.sra文件。假设有SRA Accession号，具体的操作如下：. r) R- K; i- v% A- P' F$ I
   library(SRAbd), P( Z2 e% V8 b7 r
   library(DBI)
   if(!file.exists('SRAmetadb.sqlite')) ) t9 k1 c( P( f6 R/ U
      srafile <- getSRAdbFile()1 J" `  D3 P$ l5 O$ f
   else
      srafile <- 'SRAmetadb.sqlite'
   con = dbConnect(RSQLite::SQLite(), srafile)
   df_srr <- listSRAfile(sra_accn, con) #sra_accn为已知SRA Accession号3 L. G& k- `9 `
   l_run <- unlist(df_srr["run"])
   getSRAfile(l_run, con, fileType = 'sra')5 _* D, q  _3 S/ A
如果不知道SRA Accession号，可以通过NCBI网站搜索。
第二歩：转化.sra文件为.fastq文件。我们需要下载SRA Toolkit，使用其中的fastq-dump命令来完成转换。- N3 C: z9 M4 L9 Q+ I+ ^
第三步：对应RNA片段到参考基因组。这一步，有很多工具可以实现，比如BWA，Bowtie/Bowtie2，GSNAP，TopHat2，或是STAR。这里我介绍STAR工具。STAR工具包可以在https://github.com/alexdobin/STAR/releases下载。同时，我们还需要下载genome fasta sequence文件和annotation GTF文件来产生参考基因组。以人类homo sapiens为例，我们从ENSEMBL（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-81/......）下载FASTA和GTF文件。使用STAR命令两次但是不同的参数来分别产生参考基因组和对应RNA片段到参考基因组。具体的操作如下（命令行）：, i: R3 Y+ o3 p6 X
   STAR --runThreadN 这里是个数字表示多少线程 --runMode 在产生参考基因组阶段这里必须填genomeGenerate选项 --genomeDir 这里填你希望产生的参考基因组存放的路径 --genomeFastaFiles 这里填下载的FASTA文件路径 --sjdbGTFfile 这里填下载的GTF文件路径
产生完参考基因组之后，就是对应RNA片段到参考基因组! P( M9 L7 c8 p
   STAR --runThreadN 这里是个数字表示多少线程 --genomeDir 这里填产生好的参考基因组存放的路径 --readFilesIn 这里填已经准备好的.fasta文件路径: d; _* ^% Q1 Z
这样就可以产生.sam文件，我们再需要通过samtools把.sam转化成.bam文件，操作如下
   samtools view -bS xxxxx.sam -o xxxx.bam
第四步，我们要利用产生的.bam文件获得count matrix。这也有几个工具可以实现，比如python的HTSeq包，Bioconductor的Rsubread包和GenomicAlignments包。我使用GenomicAlignments包。完成这个任务，也需要几个步骤：$ {$ w0 ~& c" A7 n  h* X
1）我们需要定义基因模型（gene models）。简单的方法是直接使用Bioconductor现有的，比如TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knowngene包；
2）产生一个GRangesList对象；9 X- `% o( E6 O6 ]% x1 T( g
3）把产生的若干.bam文件放入BamFileList对象中；
4）使用summarizeOverlaps方法产生count matrix。3 v9 Z  J; i, P6 d
具体操作如下：/ A" T# e5 H8 l' y
   library("TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene")
   library("Rsamtools")9 P' A( I  M2 l
   library(GenomicAlignments)
   bamfiles <- BamFileList(filenames, yieldSize=2000000)
   exByGn <- exonsBy(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene, "gene")
   flag <- scanBamFlag(isNotPrimaryRead=FALSE, isProperPair=TRUE)
   param <- ScanBamParam(flag=flag)
   CntMat <- summarizeOverlaps(exByGn, bamfls, mode="Union", ignore.strand=TRUE, single.end=FALSE, param=param)
最终，我们就获得了CntMat，可以开始一系列后续的分析处理了。6 R" j9 e; U  C( s/ S