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作者：罗宗键 刘建国 刘长剑 陈玉丙 李鸾作者单位：吉林大学第一临床医院 吉林大学第二医院 吉林大学通化医院学院 吉林 长春 130021 0 t/ z# S4 l# c3 z( Y& F3 o
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【摘要】 目的 建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化及扩增的方法及对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法 采用贴壁筛选法分离大鼠MSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测大鼠MSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。结果 大鼠MSCs在体外分离培养扩增，大鼠MSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81.48%的细胞处于G0/G1期，细胞生长曲线呈S形。结论 所建立的分离和培养方法获取的大鼠MSCs具有生物学特性。 , D- K# ` C- d( ~6 ?
【关键词】间充质干细胞；分离培养；生物学特性
g, W; ^5 l& d1 h! D' t4 D& X, D/ D3 n 近期研究发现，原发性骨质疏松中的成骨细胞数量和功能降低可能与骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的能力降低有关。汤亭亭等〔1〕通过观察增龄对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)数量及组织中骨形态发生蛋白-2含量的影响，证实MSCs数量的减少及组织BMP-2含量的降低可能是老年骨量丢失与老年性骨质疏松发病的重要原因。MSCs是成体干细胞之一,具有多项分化潜能,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、神经细胞及骨髓基质等组织细胞分化的潜能〔2～5〕，是组织工程中重要的种子细胞之一，具有广泛的应用前景。本研究建立了简便高效的大鼠MSCs分离方法，并对其生物学特性进行研究。: X, R9 M3 o+ g
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1材料和方法) Z- T S) a$ }( w
6 X! V5 i- w5 L, Q3 |$ n 1.1材料) N8 B ?* v4 M2 j1 r% b0 x. V* e
% Q* \0 \# e6 `3 U7 G) l) s z 健康Wistar大鼠，24月龄，雌雄不限，120 g左右，吉林大学实验动物中心提供。主要试剂：DMEM (Invitrogen corpora-tion)、L-DMEM培养基(Invitrogen corporation)，胎牛血清(Hycolne corporation)、0.25%胰蛋白酶-1 mmol EDTA(Invitrogen corporation)、RNA酶、碘化丙啶(Sigma公司)、噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(华美生物工程公司产品)、青霉素、链霉素(华北制药厂)。
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* P5 S4 w# j9 K& Q6 e r& v 1.2方法# t4 g0 ?) K: E, [" k. v
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1.2.1MSCs的体外分离和原代培养
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将大鼠断颈处死，浸入75%酒精中5 min，无菌条件下取出股骨、胫骨，剔除脂肪组织，露出骨骺端，用5 ml含10%胎牛血清的DMEM冲出骨髓，充分混匀后，1 000 r/min离心10 min，制成单细胞悬液，细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液，1只大鼠股骨及胫骨骨髓细胞量接种于1个T-25 cm2塑料培养瓶内，置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2细胞培养箱培养。12 h后弃去未贴壁细胞，更换培养液，以后每3～4 d换液1次。贴壁细胞接近70%～80%融合后，结束原代培养。. o# ?( [+ L) b4 A9 F
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1.2.2MSCs传代扩增培养
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3 v' A+ `1 U5 y. ]% E 取出贴壁细胞接近70%～80%融合的T-25 cm2塑料培养瓶，用0.25%胰蛋白酶-1 mmol EDTA约1 ml消化2 min，待细胞形态开始皱缩，用含10%胎牛血清的DMEM培养液约1.5～2 ml终止消化，并加入3～5 ml PBS，反复轻轻吹打，移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，按1∶3比例传代培养。4 E. @: r6 V A. y, F8 H+ p/ a
P$ M& t, z" u% N3 q 1.3MSCs形态学观察! S3 c5 ~0 i( i+ w0 c$ X
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相差显微镜观察原代及传代培养的细胞，用倒置相差显微镜逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征。& I# [0 T6 Y/ S/ h6 ?
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1.4MSCs的细胞周期检测8 |7 P2 H. o* [5 h
2 ~ r) l5 I5 S" {" M3 }( P( g 取第3代大鼠MSCs，0.25%胰蛋白酶室温消化后制成细胞悬液，收集大约1106个细胞，用预冷至4℃的70%酒精固定30 min，预冷的PBS漂洗3次，50 mg/L RNA酶0.3 ml 37℃处理30 min，将细胞悬液移入流式细胞仪专用试管，加入50 mg/L的碘化丙啶(PI)0.4 ml中，4℃避光染色30 min，采用流式细胞仪检测。
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1.5MSCs细胞增殖测定, N1 c$ k5 M j `, m3 i
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将传至原代、第2代、第3代培养的细胞各以1104/孔细胞数接种于96孔板中，次日起每天选择6孔细胞，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡15 min裂解细胞，使沉淀物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值(OD490)，以时间为横轴，OD490值为纵轴绘制细胞生长曲线。4 i" m" H0 A! u+ G
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2结果6 `# u7 x) e+ _) \# k
% ?2 l% @' a# G; F& @2 n) R6 q 2.1MSCs体外分离培养
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倒置相差显微镜下观察刚接种的骨髓中体积较大的单个核细胞呈球形，悬浮于培养液中。8～10 h开始逐渐沉降贴壁，48 h少数贴壁细胞呈成纤维细胞样外形，以后细胞呈克隆生长。培养4～5 d，贴壁细胞开始增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，表面颗粒少。6～8 d后部分区域形成细胞团簇，细胞呈现成纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见1～3个核仁，胞质丰富、清晰。传代培养时3～4 h开始贴壁，6～8 h贴壁完全，并向梭形细胞、多角型细胞转化，有数个突起，突起的个数及形态各不相同。传代后12 h细胞散在均匀分布于瓶底，形态重新变为长梭形成纤维细胞样，生长潜伏期较短(1～2 d)，2～3 d是细胞快速增殖期，5～6 d传代1次(图1)。
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- g y _0 D0 x0 G W5 h1 b0 o 2.2MSCs细胞周期6 H% ?+ s, v/ H( B/ l
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流式细胞仪结果显示，第3代MSCs中G0/G1期的细胞为81.48%，G2期的细胞为4.19%，S期的细胞为14.33%(图2)，大部分细胞处于静止期，只有少数的细胞处于活跃的增殖期，符合干细胞特征。
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6 v" w6 U" o+ B) D 2.3MSCs的增殖情况
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MSCs生长曲线呈S形，接种后第1、2天为潜伏期，从第3天开始细胞增殖加速进入对数生长期，第4～5天达到高峰，以后进入平台期(图3)。
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+ S9 z0 f3 \7 s# o 3讨论
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4 S1 X3 j+ c/ j2 L( _$ \骨组织微环境随年龄的增长而发生了变化，如MSCs的数量和功能下降，激素和生长因子合成减少，脂肪组织增多，骨组织血流量降低，骨髓抑制性蛋白增多等，这些改变导致老年机体骨形成功能障碍，引起老年性骨量丢失、骨质疏松、易骨折、骨折愈合缓慢或不愈合等一系列临床问题。众多研究表明，MSCs的数量随增龄而减少。Stenderup等〔6〕研究发现，虽然短期内老年MSCs增殖能力的下降并不明显，但长期体外培养时，老年人MSCs仅能成倍扩增(24±11)代，而青年人MSCs能够扩增(41±10)代。MSCs数量的缺乏使骨折局部不能募集足够量的种子细胞，从而影响骨折修复，但通过MSCs的体外扩增，使细胞在第二代时数量达到107左右，可有效解决这一问题。/ K7 Z# T6 Q! E% d6 I8 i
/ Z( U* K* \( \$ K骨髓中除造血干细胞外，还存在MSCs。基因和超微结构表明MSCs具有强大的可逆性〔7〕。骨髓中MSCs的含量很低，约为0.001%～0.01%，要利用MSCs就必须实现MSCs的体外分离培养和扩增。因此，如何从贴壁的异质细胞群中分离得到较为纯化的MSCs具有十分重要的意义。目前用于分离MSCs的方法主要有3种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。贴壁筛选法具有操作简便，费用低廉，效果切实可靠的优点。实验表明贴壁法分离大鼠MSCs可传10多代，仍能保持旺盛的生长和增殖能力〔8～9〕。故本研究采用贴壁筛选法获得MSCs，进一步培养贴壁细胞呈现多种形态，主要为成纤维细胞样细胞，呈长梭形，带有2～3个突起，细胞核较大，扁圆形；部分为扁平的不定型细胞，细胞扁平，胞体较大，形态不规则，胞浆可向不同方向伸出伪足。因成纤维细胞样细胞在数量上占优势，所以传代后的细胞呈均一的梭形。: ]# U; u/ ~+ }) d& T
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本研究表明，在生长过程中rMSCs经历潜伏期、对数增殖期和平台期，生长曲线呈S形，符合正常细胞的生长特性，且倍增时间短。传代后大鼠MSCs贴壁时间缩短，增殖速度加快，接种后5h就有80%以上细胞贴壁，每传代1次细胞数可增加2倍左右，扩增至5代细胞数可达(4～5)108个细胞，表明该分离培养获得的大鼠MSCs在体外有较强的扩增能力，本研究所采用的细胞培养条件适于大鼠MSCs的纯化和扩增。实验过程中我们发现，如用PBS缓冲液清洗细胞2～3次再进行培养，细胞增殖明显比未清洗的要快。这可能是因为简单换液仍保留了少量的造血干细胞，能分泌促进造血干细胞增殖的因子，引起造血干细胞大量增殖，抑制MSCs的增殖。因而PBS清洗能去除造血干细胞，有利于MSCs的增殖。9 o) ^# l/ S4 u4 r7 \
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