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发表于 2009-3-3 12:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：黄艳，李莹辉，杨芬，戴钟铨作者单位：中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室，北京 100094
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      【摘要】  目的研究在体外5氮胞苷诱导骨髓间质干细胞定向心肌向分化的条件。方法取成年SD大鼠胫骨/股骨骨髓，分离并培养骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）。原代第3天用不同浓度5氮胞苷作用不同时间。用免疫组化方法鉴定心肌肌钙蛋白（TnT）的表达，并通过RTPCR鉴定GATA4和βMHC的表达。结果诱导后BMSCs细胞增生趋于停滞，10 d可见细胞变成长梭状，20 d细胞排列出现方向性，有TnT阳性细胞出现，并表达GATA4和βMHC。随着诱导药物5氮胞苷浓度的增加，免疫细胞化学染色TnT阳性细胞增多，且表达更多的GATA4和βMHC，至5×10-5 mol/L时基本达到峰值。5氮胞苷对BMSCs的持续性诱导并不能明显增加免疫细胞化学染色TnT阳性细胞数量和GATA4、βMHC的表达。结论 5氮胞苷诱导后BMSCs可向心肌细胞分化，是临床心肌细胞成形术理想的供体细胞。
      【关键词】骨髓间质干细胞；心肌向分化；5氮胞苷;免疫组化法；RTPC; o$ L8 r& F* b2 _
   　　骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓来源的具有较强的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，在一定的条件下，可以定向诱导分化为多种成熟体细胞如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等，为各种组织的修复和重建提供良好的细胞来源［1］。如心肌损伤后由成纤维细胞填充，为瘢痕所替代，逐步发生心室重构，心肌功能明显减退，最终导致心力衰竭。近年来，利用BMSCs诱导分化为心肌细胞，移植于受损心肌可改善心肌缺血及心脏功能［2］。研究表明，体外BMSCs在5氮胞苷诱导下可以定向分化为心肌样细胞［3，4］，但其分化# x5 `5 l: h' d( y& Y

还不稳定，分化效率较低，最适条件仍不确定，BMSCs心肌向分化的调控因素尚不清楚。本研究观察化学因素5氮胞苷体外诱导大鼠BMSCs向心肌细胞的分化，探讨不同诱导浓度和时间对心肌向分化的影响，为研究重力因素对BMSCs向心肌细胞分化的影响奠定基础。

　　方　法! i- I  I9 o6 O  z) B. I
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　　实验动物
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　　SpragueDawley(SD)雄性大鼠，4周龄，体重150～200 g（维通利华实验动物中心）。% S6 g1 ?9 t9 e5 g: `# U/ ~8 P7 L

　　试剂仪器' H: U; |; i& ~' i

　　低糖DMEM干粉培养基(美国Gibco)、胎牛血清(奥地利PAA)、5氮胞苷(美国Sigma)、山羊抗鼠肌钙蛋白T单克隆抗体(美国Santa Cruz)、辣根酶标记的兔抗山羊IgG(中国中山)、DAB浓缩显色液(中国华美)、总RNA提取试剂TRIzol Reagent(美国Gibco)、RTPCR引物(中国赛百盛)、Access RTPCR试剂盒(美国Promega)。CO2恒温培养箱(美国Queue)、倒置相差显微镜(日本Nikon)、普通光及荧光显微镜(德国Leica)、9700型PCR仪(美国Perkin Elmer)。6 s* P7 o+ P' y( K) m; x9 E  j7 N
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　　BMSCs的分离培养' {& h$ K7 z0 E0 F( A

　　处死大鼠后取股骨和胫骨，去除软组织，切除两端，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，将冲洗液收集于离心管中，于1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于培养瓶中，置于37℃，含5%CO2的培养箱中培养。3d后弃悬浮液，加入新培养基，每3 d换液1次。当细胞接近90％铺满瓶底时，用0.25%的胰酶消化传代。. H3 L1 C8 V; C* G( V! r  L& J$ ^9 M* E5 ]! [
$ ~: n- z4 y! t* f8 f! ~' ]
　　5氮胞苷诱导BMSCs心肌向分化的浓度相关效应6 c; _$ x! Y$ X% d# M4 t% c% p

　　原代培养的BMSCs接种于培养瓶，培养第3天加入5氮胞苷诱导，终浓度分别为1.010-6 mol/L、1.010-5 mol/L、5.010-5 mol/L和1.010-4 mol/L。诱导24 h后，去除5氮胞苷更换为正常培养基，以后每3 d换液1次，连续3周。
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　　5氮胞苷诱导BMSCs心肌向分化的时间相关效应# _9 ?; ^2 e1 t' }) [' O4 I: s. f. |
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　　原代培养的BMSCs培养第3天以5.010-5 mol/L 5氮胞苷分别诱导24 h、48 h和72 h，去除5氮胞苷更换为正常培养基，以后每3 d换液1次，继续培养3周。" }2 T9 K1 n" d: e+ T
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　　心肌肌钙蛋白（TnT）的免疫细胞化学染色方法2 A6 q& P6 b2 M1 i) [
' a- E0 P8 C. e- N( f$ s! y
　　以PBS（KH2PO4 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，NaCl 8.0 g/L，pH=7.4）漂洗数次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；0.1%Triton X100处理10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；1%牛血清白蛋白封闭30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；与羊抗鼠TnT单克隆抗体(1∶100)于室温孵育120 min；PBS漂洗3次，每次5 min；辣根酶标记的兔抗羊IgG(1∶100)于室温孵育90 min；PBS漂洗3次，每次5 min；将DAB浓缩显色液稀释后滴加于玻片显色，以PBS浸洗终止反应；苏木精复染3 min，盐酸酒精分色30 s，PBS清洗；脱水，透明，中性树脂封片；显微镜下观察并成像。

　　GATA4和βMHC基因表达的RTPCR检测方法　　5 N. w$ f3 Q8 o" O1 ~0 m# |
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　　GATA4和β肌球蛋白重链（βmyosin heavy chain，βMHC）基因的全序列从NCBI数据库检索，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，所用引物序列见表1。采用TRIzol试剂提取总RNA，经分光光度计进行A260及A280定量后，参照Promega试剂盒操作说明书对GATA4和βMHC同时进行RTPCR。取PCR产物10 μl，经1%琼脂糖电泳，紫外光下观察，经凝胶成像系统摄像。表1 RTPCR引物（略）

　　结果+ _9 [4 o; h) Y
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　　5氮胞苷诱导培养后的BMSCs形态变化　　
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　　诱导前BMSCs的形态：首次3 d换液后可见贴壁细胞散布、成纤维细胞状，而悬浮细胞小、球形，一般换液2～3次可以去除，3～4 d后贴壁细胞逐渐呈现集落生长，5～6 d后生长加快，约14 d细胞可达到近80%铺满瓶底。如不传代，细胞可相互重叠生长，形成细胞团块，传代24 h细胞可贴壁，体积较原代细胞增大、扁平、均匀（图1A）。　　
2 Q2 ]! q0 e6 C1 p. X
　　诱导后BMSCs细胞增生趋于停滞，10 d细胞变成长梭状，20 d排列出现方向性(图1B)。
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　　5氮胞苷诱导对BMSCs的TnT蛋白表达1 D1 U2 F9 _: w6 p% V% d* @1 `$ j7 ]

　　TnT 免疫细胞化学染色发现，未诱导BMSCs没有TnT阳性细胞(图2A)，诱导后BMSCs有TnT阳性细胞出现，形态为梭形和多角形（图2B）。* C2 E( y/ T8 r' U* J6 N( D$ d
& B! G/ r5 s" R& Y; W: ^
　　5氮胞苷诱导对BMSCs的GATA4和βMHC基因的表达
) t, u0 }. k5 W+ L( Z  ]- F4 x
　　与正常心肌细胞阳性条带对照，诱导后BMSCs的也在相同位置出现GATA4和βMHC表达的阳性条带，而未诱导BMSCs没有阳性条带出现(图3)。5氮胞苷诱导BMSCs心肌向分化的浓度相关效应　　
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　　在一定浓度内，随着诱导药物5氮胞苷浓度的增加，免疫细胞化学染色TnT阳性细胞增多，且表达更多的GATA4和βMHC，至510-5 mol/L时基本达到峰值。5氮胞苷终浓度增加至110-4 mol/L时，细胞脱落死亡严重，更换为正常培养基后不可恢复(图3A)。5 }7 l2 a$ ^6 t1 ~# Y& E

5氮胞苷诱导BMSCs心肌向分化的时间相关效应　　

　　5氮胞苷对BMSCs的持续性诱导并不能明显增加免疫细胞化学染色 TnT 阳性细胞数量和GATA4、βMHC的表达。用510-5 mol/L5氮胞苷诱导48 h和72 h，细胞脱落死亡严重，更换为正常培养基后不能恢复(图3B)。! q: y; T5 Y7 p4 Q

　　讨论　　

　　TnT仅在心肌细胞中表达，是鉴定心肌细胞的特异性蛋白；βMHC为心肌特异性蛋白，分为αMHC及 βMHC 两种亚型，前者见于胚胎型心肌细胞，而后者在成熟心肌细胞中表达；GATA4作为GATA 转录因子家族的成员，具有两个锌指结构，在心脏中特异性表达，它除了直接调控心肌细胞结构基因和调控基因的表达，还可与几种心肌基因调控区的DNA 结合，参与心肌细胞的分化，抑制GATA4 的生成，或应用RNAi 抑制GATA 可使心肌细胞的分化受阻。TnT、βMHC和GATA4的表达量在分子特征上反映BMSCs心肌向分化情况。本实验诱导后的细胞表达TnT，GATA4和βMHC, 这些现象揭示5氮胞苷诱导后BMSCs可向心肌细胞分化。　　) v& t* q" l8 R/ t. @& d
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　　5 氮胞苷是一种去甲基化药物，推测其诱导干细胞心肌向分化可能与其和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型改变从而使启动细胞向心肌分化，使BMSCs转变成心肌细胞［4］。本研究显示：在一定范围内，随着诱导药物5氮胞苷浓度的增加，免疫细胞化学染色TnT阳性细胞增多，且表达更多的GATA4和βMHC，至510-5 mol/L时基本达到峰值。5氮胞苷终浓度增加至110-4 mol/L时，细胞脱落死亡严重，且不可恢复。5氮胞苷对BMSCs的持续性诱导并不能明显增加免疫细胞化学染色TnT阳性细胞数量和GATA4、βMHC的表达。用510-5 mol/L 5氮胞苷诱导72 h，细胞脱落死亡严重，撤去后不能恢复。　　( B1 T/ y" p3 a6 c3 I* ^* a

　　本实验选择在原代培养第3天换液时加入5氮胞苷诱导BMSCs心肌向定向分化，然后再培养3周。Malaval［5］等认为应将BMSCs体外培养多次传代纯化后，再用5氮胞苷诱导，因为在稍晚一些的时候进行诱导细胞量多、比较均匀，但是本研究过程中发现传代细胞形态扁平、且容易多向分化，所以本实验选择用原代细胞进行诱导［3］；BMSCs在原代培养5～6 d后生长加快，继续培养，细胞有形成骨结节的趋势，可能是由于BMSCs中的碱性磷酸酶系统在培养后第4天启动，而碱性磷酸酶可以促进BMSCs向成骨细胞转化［3］，所以本实验在原代培养第3天加入5氮胞苷，诱导BMSCs向心肌样细胞转化；在7 d和14 d取出细胞，形态和免疫细胞化学染色未见明显变化，而21 d和28 d阳性反应明显，因此本实验在5氮胞苷诱导后培养3周以后再做鉴定，这表明5氮胞苷诱导后需要较长的反应期，才能使BMSCs心肌向分化。本实验诱导后BMSCs细胞增生趋于停滞，形态变成长梭状，排列出现方向性，诱导后细胞表达TnT、GATA4和βMHC, 这些现象证明原代培养第3天加入5氮胞苷再培养3周可以诱导BMSCs向心肌样细胞定向分化。　　
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　　BMSCs向心肌细胞分化调节是一个多层面、多因素的系统。基因调控因素有待进一步研究。环境调控因素包括化学分子5氮胞苷、条件诱导培养基、共培养和损伤等。5氮胞苷可以在体内外诱导骨髓来源的细胞诱导分化为心肌细胞［3， 4］；在含有胰岛素、地塞米松、抗坏血酸等培养基中培养的BMSCs能向心肌样细胞分化［6］；与胚胎心肌细胞共培养对其分化也起重要作用［7］；机体的严重损伤对骨髓来源细胞的分化也有促进作用［8］。新近空间生命科学研究发现，力学因素参与细胞的分化发育，影响BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化［9］。本实验室研究表明，离心超重促进BMSCs向心肌样细胞分化，而模拟微重力抑制BMSCs向心肌样细胞分化。因此，力学因素也影响骨髓干细胞向心肌细胞分化。+ B7 C8 Y# Y: M1 s3 F9 r* m* ~

　　结论4 T4 `& d9 e# h" N7 S/ f
  T) |( p, V; {0 H
　　综上所述，BMSCs可以在体内外诱导分化为心肌细胞，但是目前分化条件仍不确定、过程尚不成熟，仍需进一步的实验研究。BMSCs抽取容易，体外扩增能力强，自体来源无免疫排斥反应，是临床心肌细胞成形术理想的供体细胞，随着许多相关问题的解决，BMSCs治疗将会成为治疗心肌损伤的有效方法。
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