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诱导iPSCs 过程中的疑惑 [复制链接]

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楼主
发表于 2014-10-5 09:59 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
  最近,在利用TetOn 的慢病毒系统诱导猪的iPSCs,有一些疑惑想跟大家交流下!8 |/ z" x, E' z- ?) ~. H
0 z6 y# ^. j& {. u3 r
1. 载体基本元件的顺序为0 P& ~& t7 P- y: E
含目的基因(OSKM)载体:Lenti-EF1α-EGFP-TRE-oct4,含rTTA的载体:Lenti-EF1α-rttA-IRES-EGFP;( f' E3 l7 p7 w& R" h) e
在用293T细胞系进行病毒包装时,用的各种物质的量和步骤都一样,结果发现含目的基因载体的病毒滴度明显优于含rTTA的载体的病毒滴度,想知道有哪些因素可能导致这一问题?同时在病毒包装过程中,发现有一批质粒出现了污染,重新进行无菌处理,发现细胞还是出现污染(在高倍镜下出现蠕动的小虫,有点恶心哈),想问下这又是哪出了问题(基本排除操作引起的污染)。, [( Z5 ~1 Y$ R6 K) r

: n1 T/ O" c8 i- `. a1 m2. 在进行AP染色的时候发现一种现象:; L/ J" T1 f& ^+ `; s
     对形成的克隆进行AP染色时,发现没形成明显克隆或已开始分化克隆的边缘呈现AP 阳性,而正常的克隆确呈现AP 阴性,想问下这是否有可能是由于克隆细胞密度较大,不易着色导致的嘛?后面将补充图片···
/ T4 Y# q4 a) ~' R6 v/ s      还有一个问题就是,是否有一种可能AP 阴性的克隆随着培养和传代,慢慢的变成了AP阳性的克隆?9 k0 K9 c" [9 E0 c. z

  m6 u: M# I+ V( x$ _! |- ~3. 挑取克隆时间等问题) \( L7 k& K9 E0 `) e) |% V( g7 s+ `
    不知道大家是根据什么确定挑取克隆的时间的;前段时间挑取一个不规则的克隆(不呈现标准的圆形或椭圆形,体积适中)消化成单细胞至lif-2i体系和基础培养基体系中,发现前者第二天大量死亡,而后者3d时也没有形成克隆;而差不多大小的圆形克隆能支持单细胞传代; 4 D$ B3 _* e1 }0 D3 e9 K
% h" h( `2 G" U3 z" ]8 V" c* ?/ A
4. 克隆问题3 t1 @1 D3 A' L) a9 ?& ^& b! k* Z
   目前,自己获得的克隆进行单细胞传代后大概2-3d能形成克隆样(此时像小鼠iPSCs样克隆),但随着时间的推移,发现慢慢地向人iPSCs的形态发生转变;并且大部分克隆不发绿色荧光(7孔中6孔不发荧光,荧光为EGFP见载体,这能否说明外源性的OSKM已不表达,而内源性的调控网络可能激活?而最后一孔出现了一种奇怪的现象:出现了两种形态和颜色明显不一样的克隆A(跟其他6孔一样)和B(相较于A明显小一圈,且是在克隆A出现后3d左右大量出现的),其中A不发绿色荧光,而B发荧光(很强),后面将附图说明。有人帮忙推断,这有可能是细胞不纯 或 细胞癌变 导致的。并且这些克隆基本上(出现了如上AP染色问题,所以用了基本)呈现AP 阴性,但A克隆能支持单细胞传代,B克隆正在试验。
* m, e5 |* r- x0 H# V% F. ^  W   由于使用的是DOX系统,根据个人的认识,好像猪iPSCs 上这样的克隆都需外源添加 DOX等维持外源OSKM的表达,而维持克隆的未分化状态。在小鼠上,好像看到个一篇用TetOn系统诱导的克隆,在撤除Dox后,细胞还能维持未分化状态,说明其内源性的多能性调控网络已激活,但这篇文章找不到了,不知道有没有高手提供点线索。在猪上自己还没有见到过这样的文章,不知道有没有可能存在这种情况。目前,试验缺少重复,还需完善;并且图片还没拷贝出来,后面将附图,希望大家根据自己的知识解答下我的疑惑。/ g4 N0 f* H) l& E8 \
  L  a+ Q$ |& g( v% a- h0 T$ n
补充内容 (2014-10-5 19:35):( x+ t) N. s6 d" w- _( s0 \
今天发现 B 类克隆保持了之前克隆的形态和颜色,而A 类克隆是在 B 类 克隆进行单细胞传代后形成的克隆,目前该克隆的增殖能力还在检测当中(之前的判断有误或存在偏差,没有直接证据证明该克隆能支持单细胞传代)
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沙发
发表于 2014-10-5 19:27 |只看该作者
下面三幅图片分别 克隆形成初期 中期 后期,其中初期和后期呈现部分AP阳性,而中期为阴性
& j( S' _( [- K% a9 }) R7 |( M6 A' X; _! I  K5 L# m$ _
补充内容 (2014-10-5 19:29):4 p+ ]2 x& n6 P
图片 不是 很好 编辑和 排序
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藤椅
发表于 2014-10-8 17:07 |只看该作者
在Rudolf Jaenisch lab 所发表的iPS 文章中,使用FUW-Tet-on系统制备的iPSCs,在后期撤除Dox后,iPSCs基本上可以维持pluripotency。  a- b  k- \3 {- P4 m
但是Dox诱导体系,并不是绝对精准调控的体系,在撤除Dox后,外源基因也可能会表达。
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板凳
发表于 2014-10-8 21:06 |只看该作者
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回复 zhangweihwz 的帖子  z$ N* k* U7 }, C/ H' _

  B5 g* Z' q3 u+ c谢谢你的回答!, ]  `- ]6 W! h1 K3 d

( u$ a" e/ J/ f! y& R经过这几天的实验,发现 A  类克隆呈 AP 阳性,而B 类克隆部分呈现AP阳性,并随着B类克隆的单细胞传代,也会逐渐变成A 类克隆(部分变成)----初步判断 A 类克隆的重编程程度高于B,B是重编程过程(体细胞-A 克隆)中的一个阶段;明天上图6 `0 j' G4 q* ?5 I  g

" D  Y$ `* t8 K* L1 e" a4 U同时,对A类克隆撤除DOX后,发现细胞克隆形态还能维持,且用Tryple 消化传代发现,细胞增殖速率也挺好(1:7传代,24h后能明显可到克隆,且密度较大),明天上图吧!
* i& C# _+ ?) C: X1 u5 }. m) I0 e& t
& D# i2 j+ a- S4 p还有一些检测还在进行当中,如免疫荧光染色!: K, o# r. ~. ]" u
9 g( ^! i" y$ y& n
目前的问题:
1 N' e  h; b0 x! e, m* M; g1. 不能确定A 类克隆的内源性调控网络是否建立(如OSKM的表达),不知道有什么好的方法没???
5 I+ A, x8 v: h0 s. z! Z# w2. 不知道A 类克隆是否来源于猪的体细胞,还是混杂了其他的细胞(如饲养层细胞,或者细胞建系时混了一些其他细胞);
( p) _1 O( ~) x$ V3 o  e- `$ }3. 实验缺乏重复,真担心再次诱导不会像第一次这么幸运。. z8 H5 y1 ^, f8 G3 y% u7 y7 x
9 s: y# M9 v% m% N
还麻烦zhangweihwz 提供下 你说的文章题目,这样我好检索(最好能上传下),谢谢!
) V* T6 B3 \- H( E

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发表于 2014-10-8 21:28 |只看该作者
回复 zhangweihwz 的帖子9 U( ]1 p$ `  @* d

$ f; |0 s5 v9 `% G想问下是 2008年在cell stem cell 上的文章-Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells-嘛?期待你的答复,这个对我真的很重要? 可以的话还麻烦推荐一些相关的文献,如在人 上是否有相关的案例!
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