Nature子刊：“双重锁钥”RNAi高专一性递送方案

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Nature子刊：“双重锁钥”RNAi高专一性递送方案
' a' J  ~' A# K' a9 {" K% h来源：药明康德 / 作者： / 2016-12-01+ V+ T. O3 u8 q9 l
能够选择性静默特定基因、下调相应蛋白表达的RNA干扰（RNAi）技术正成为“精准”治疗人类疾病的一个新希望。然而，要想让RNAi真正能用于临床，就必须解决递送的问题，即将RNAi递送到目标细胞中去，否则不仅会使效率大大降低，还会因脱靶效应造成不良的副作用。为此，有人设计将RNAi结合到能识别特定细胞表面标记的蛋白或核酸适配体（aptamer）上，以实现靶向递送。不过，由于一种生物标记往往不仅仅表达于单一类型细胞的表面，这种方法仍然难以有效克服脱靶效应的问题。
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因此，人们可能需要利用一种以上生物标记的组合，将能够识别它们的配体与RNAi连接起来，才能够更加专一地进行靶向递送。这就有些像是在RNAi操作中，siRNA上的配对序列必需足够长，才能保证其在被递送至细胞内后，能够只结合于目标序列而不会脱靶。同理，在RNAi向细胞的递送中，只有递送载体与目标细胞的标记配对足够多，才能保证其不会进入其他的细胞中。
# S  n6 C1 Y) M& ~* w最近，南京大学化学化工学院鞠熀先教授的团队就实现了这样的思路。他们发明了一种利用“双重锁钥”（dual lock-and-key）机制的RNAi递送方案，通过让载体识别目标细胞表面的两种标记，达到了RNAi向单一细胞类型的专一性递送。同时，该载体还具有高载量和保持siRNA稳定性的优点。这一成果发表在近期的《自然》子刊《Nature Communications》上。
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6 l* @7 r1 L3 J- S6 ~# ~研究者首先以五种寡核苷酸链自行聚合成“三角梯单位”（triangular rung unit, TRU）的基本结构单元，后者在每个角上均伸出一对突出端（overhang），后者中的两对可与siRNA杂交，从而将其绑定在TRU上。接着，这样的多个TRU会以其尚未结合有siRNA的一角上的一对突出端与一长单链DNA结合，形成可用于RNAi递送的寡核苷酸纳米载体（oligonucleotide nano vehicle, ONV）。这样的一个siRNA-ONV就是“双重锁钥”中的“钥”，其平均长度约有0.6微米，总共能装载约84条siRNA。其中，长单链DNA由滚环扩增的方式合成，在其游离的一端可形成发夹结构，后者将发挥与目标细胞标记识别的作用。
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当然，siRNA-ONV并不能直接识别细胞表面蛋白，而是借助于核酸适配体的作用。核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，其本质是一段单链核酸分子，通过折叠形成特定三维结构，可与蛋白质、核酸等生物靶标进行高亲和力和高特异性的结合。. t& g5 m) w$ C  M" x5 c
研究者以人急性淋巴细胞白血病CEM细胞系为靶标，采用了均可选择性结合于该细胞表面的sgc8c和sgc4f两种核酸适配体，后两者即“双重锁钥”中的“锁”。其中，sgc8c可结合细胞表面的受体酪氨酸激酶7（RTK7），而sgc4f的结合位点目前未知。另一方面，sgc4f本身还具有MNAzyme核酸酶的活性，可识别并切割ONV发夹结构上的特定位点，从而在该处形成自由的DNA单链片段，后者可与sgc8c上的互补片段杂交，最终让siRNA-ONV结合在CEM细胞表面。( H) N3 X9 {$ O9 ^
  
; I  X" s6 c1 f0 c5 i2 P% Z( O) ~, I实验显示，siRNA-ONV与CEM细胞的结合是高度专一的。只有当sgc8c和sgc4f同时存在时，siRNA-ONV才能与CEM细胞结合，而且此时的人宫颈癌HeLa细胞（只能与sgc8c结合）以及人Burkitt淋巴瘤Ramos细胞（只能与sgc4f结合）完全无法与CEM细胞竞争结合siRNA-ONV。如果这时仅用单一的细胞表面标记，人们便难以将CEM细胞同时与HeLa和Ramos细胞区分开。# B3 G  a' t' F0 D& t) M
结合于CEM细胞表面的siRNA-ONV依赖于clathrin的内吞作用进入细胞，并可在接下来从胞内体中释放出来，使siRNA进入细胞质中。在这一过程中，ONV的DNA骨架保护了siRNA的完整性，使其不轻易被降解。
% T6 P5 g$ C2 P研究者以血管内皮生长因子（VEGF）基因为RNAi的靶标，检验了siRNA-ONV的效果。VEGF表达于CEM细胞，在血管生成中发挥重要作用，其过表达与多种肿瘤的发生有关。与lipo2000和TransIT两种常用非选择性RNAi递送方法相比，ONV表现出了更小的细胞毒性（转染后细胞存活率达96.5%）、相似的基因静默效率（VEGF表达水平下降了近一半）和生长抑制效果（约一半的CEM细胞发生凋亡）。然而，由于具有专一性，由ONV递送的VEGF siRNA在CEM异体移植肿瘤模型小鼠体内表现出了比lipo2000和TransIT显著更优的肿瘤抑制效果。% Y$ w* X% d# v/ ~
这样的siRNA-ONV“双重锁钥”方案提高了RNAi递送的专一性，能够以“双重保证”防止脱靶效应，为RNAi疗法的开发提供了新的思路。9 i& A! p0 Z& f
参考资料：
, F6 [6 L3 g4 D4 r; `$ G' H+ a[1] A DNA dual lock-and-key strategy for cell-subtype-specific siRNA delivery3 X5 F' u, Y5 H) o) X3 n% D. l
[2] Aptamer: Wikipedia
- K' v2 J% u2 ?" ]来源：学术经纬
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