人骨髓间充质干细胞 铺24孔板难题。。。附操作步骤。。。求解求救

dimi_luki

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最近将 人骨髓间充质干细胞 铺24孔板进行后续实验时遇到些许问题，想与各位朋友讨论下：( x- X& m8 T5 n9 p
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1.我的细胞都是长满到近90%左右时，消化下来计数后铺板，第二天观察发现总是铺得不平均（注意是不平均，不是不均匀，就是各个孔之见细胞数明显有点差距），在铺板过程中我已经比较注意了，先用1ml枪吹打匀，然后没加3-4孔就摇匀细胞悬液。不知道大家有什么好的方法解决这个问题。5 M, Z* t; G' ]
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2.铺板结束后50ml离心管内还剩余小部分细胞悬液，斜置于显微镜下（40倍镜观察）发现竟然有很多细胞聚集成团，我马上意识到可能板里也有部分孔有细胞团，然后将4块24孔板逐孔观察，发现确实发现有部分孔有成团细胞（可能是在消化前的培养板内就已成团，或是重悬在离心管内时聚集成团）。这样各孔细胞数差别更大。
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; v. i! R+ \4 P( B: @: W各孔细胞数不平均或部分孔内有成团细胞对后续实验的数据影响必定很大。。。不知道有什么解决办法。。。: s% X( G! E& |; c

8 _8 ]  x/ y/ L5 [, t【以下是我铺孔的操作步骤：】' B4 ~3 ?) F, G1 [, ^
1.取4皿100mm直径的汇合度近90%的人骨髓间充质干细胞的培养皿，弃去旧培养液，用PBS 3ml/皿洗两次，加入1ml 0.25%胰酶+EDTA，37℃消化1min（细胞皱缩，微贴皿壁），立即吸去胰酶，加入2ml 每孔的培养液，中和剩余胰酶。
6 y; }# y! L0 S2 v2 C2.吹打细胞离壁，转移4皿的细胞悬液至50ml离心管，吹打混匀。取其中10ul，稀释100倍计数。计算后取其中适宜体积的悬液至另一50ml离心管，稀释到目标细胞浓度——1*10^5。（因需要4块24孔板，每孔0.5ml，需要96孔，则共需要细胞悬液48ml。考虑到不能将50ml离心管内悬液稀释到48ml，这样吹打混匀不可行，所以预先4块24孔板内加入每孔0.4ml的培养液，然后只需每孔再加入0.1ml的细胞悬液后混匀即可。计算下来，只需要稀释到目标浓度的悬液0.1ml/孔*96孔=9.6ml，未避免操作损失，我配置了15ml的1*10^5的细胞悬液）% d; o* M4 w$ s% U" M0 v
3.再次把15ml细胞悬液吹打匀后铺板，每铺3-4孔摇匀离心管。! c5 d: y! _% V9 }. L& x& k
4.全部铺完后，左右上下稍微剧烈的摇晃培养板，镜下观察确保孔内细胞基本分布均匀。
' |9 ^7 Y1 t: n+ K4 x; U5.然后就发现上述悲剧了。。。不知道还有什么地方需要改进的。。。苦恼啊。。。! i" Y& j. V. \! n1 E0 l

pengxuleo

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”普通培养瓶也就是10的5次方，最多三二十万的细胞量“ -----这是T-25吧，一般样MSC都用T-75，T-175,还有更大的培养瓶。

细胞海洋

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9 P' @$ a/ J4 e% P- M8 @, r3 H* f建议你发新帖提问

fengxiwu

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5 T: `1 N) O. D* ~& A& t: Q2 X$ ~* [- Y6 j7 }3 P4 F% Q! b
你写的很详细-----学习了。你的最终浓度msc24孔板1万细胞？   msc的大小你测算过吗。我的估值在100-150微米的长度。细胞核多是椭圆型，核仁1--3个，平时冻存，除非是几个培养瓶中的集中到一起----密度不过几十万每毫升。六孔板100%融合也很难达到10的5次方msc细胞。普通培养瓶也就是10的5次方，最多三二十万的细胞量。
7 K2 E; {+ r# d( N1 g  a0 K6 t1.感觉msc细胞很容易重悬，很少遇到msc细胞团的情况（细胞正在分裂，藕断丝连的情况除外）。倒是白血病骨髓分离的单个核细胞在细胞量特别大的情况时，不论是冻存与否，成为粘性细胞团不能吹散------15次遇到过两次（随培养时间的延长，自动又分散开了，但是培养结果不好）。
6 _3 @% X  w1 ~/ S% A- z6 K2.msc的消化确实很容易，室温下有时也很快的。细胞皱缩之后，一拍打就全都悬浮起来了。但是也确实遇到过胰酶消化不理想的时候。不知是否同细胞状态有关------老化？分化？还是生长时间太长未处理以及胰酶或者pbs冲洗不充分的原因。？
; k+ C/ w. d6 R6 I4 Y5 u* V! X3.孔板中培养经常遇到的是不均匀的情况，中央密集周边稀疏，也有周边比中央 密集的时候。各个孔中密度不均匀自然是同母液的处理有关了。7 Z3 z- p# J6 A5 z
    很多文章中涉及msc的，不论是冻存还是传代、培养，密度在10的6次方的，真不知道人家的细胞同咱们的为什么就差别这么大------真实点就这么难。弄的人心惶惶

camus

mark一下，跟着学习学习

ditiger

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胰酶浓度太大，一般用0.05%的，太大会损伤细胞，吹打时一定要均匀用力，最好不要起泡沫。吹打几十下，应该都会是单个细胞悬液了。

dimi_luki

8 _& S. _( r* z& t: r

xbs530515 发表于 2012-6-23 11:36
: H3 P8 S5 \0 T1 Q& ?楼主，下一次请仔细观察一下，刚消化后的细胞是否已经有部分成团？个人认为，问题很有可能出现在此。具体注 ...

2 Z* s" V: T4 Z  A6 j
* A9 O, P1 |4 I7 M好犀利的解答。。谢谢大神。。消化完用离心的我也试过，但是发现离心后的细胞沉淀就像粘性很高的物质一样（只有这类干细胞会出现这种情况，其他的肿瘤细胞什么的都不会，能马上重悬），我感觉吹不散，吹打太多又怕太损伤细胞了，所以之后我就都是吸去胰酶+EDTA，然后培养液中和，你说到的EDTA不能被中和，但是EDTA对细胞贴壁倒也没发现太多影响。。不过以后我会注意一下。。

xbs530515

楼主，下一次请仔细观察一下，刚消化后的细胞是否已经有部分成团？个人认为，问题很有可能出现在此。具体注意事项：8 m! x" G' ]0 a+ O6 p/ ]" v! l+ X
1，根据经验来看，你消化时间不长，1min细胞估计能够下来，但不排除有部分细胞本身还是成团的，你计数时有没有注意这点？! S1 c8 D+ k# x  w0 }1 ?9 D  N
2，由于你消化液里面用到EDTA，这是不能用血清中和掉的，虽然终浓度不高，但这一步最好离心，弃上清后，再重悬，充分吹打混匀，再进行计数，重点观察有无细胞团。
8 Y( p/ d1 Q. n) L# }3，就你所需的48ml细胞液来看，建议不要配5倍浓缩的，本身体积不大，可以考虑用一个100ml的血清瓶直接配制50ml原液，其优点关键在于，你用100ul的移液器根本不好混匀，而用500ul则肯定能够吹打混匀。
( {" N2 o! w4 |4，接好的板子，通过划十字的方式摇匀即可，没有必要非得用移液器吹打。
: F( C3 r' S7 l: m# B( {# W总的来说，我个人认为，你配好的细胞，在接板的几分钟内成团的可能性不高，很可能是在消化那步造成的，请仔细观察。

dimi_luki

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asa_ok 发表于 2012-6-21 10:47
4 E7 T0 u' D! K" l7 x没有用10cm培养皿养过MSC，但大同小异，发现lz有好多的操作很……/ T2 j" b  t1 c3 l
1.  “37℃消化1min（细胞皱缩，微贴皿壁 ...

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1和2：消化细胞这个貌似可以离心可以不离心，是看了很多帖子后总结的，碧云天的胰酶操作说明书也是先消化，等细胞差不多快离壁时吸去胰酶，加培养液中和，再把细胞吹打下来。。。每个人有每个人的操作习惯，这个没什么好说的。。。另外我是4皿细胞一同加到50ml离心管内了。我没明白你叫我一个板子一个板子12ml的加。。。是我把细胞悬液分成四份，每份稀释到12ml去加？囧，呃。。。这样貌似也行。。6 i6 k3 G/ H) {6 L. R" V
3：这个我倒真没考虑到，因为我先加了每孔0.4ml的培养液，再加入0.1ml的细胞悬液，用的是100ul的枪，100ul在15ml的细胞悬液里吹打。。。。这个。。。这个。。。是不是没啥效果，所以我用了摇的方法。。$ [0 D9 N0 p; ?0 {1 o
4：这个方法挺灵的，我也是网上找了很多总结出来的，每孔500ul，稍微剧烈的摇晃绝对不会溅出来，摇完后镜下观察细胞很均匀。。。这样减少了一孔孔去吹打的操作，污染风险也小了。。
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- |! T2 R' y1 q! Q谢谢大侠指点。。收获不少。。。

asa_ok

没有用10cm培养皿养过MSC，但大同小异，发现lz有好多的操作很……/ }$ e5 u* l9 U& {9 W1 Y
1.  “37℃消化1min（细胞皱缩，微贴皿壁）”----消化时间很短，我们培养瓶的一般3-5min左右，看到细胞浮起后再处理；
: C( a- I! d5 L* n  x& A5 A% ?     “加入2ml 每孔的培养液，中和剩余胰酶。”----我终止酶解不用培养基，而是用血清中和；
- K4 i" U6 b+ x3 p0 z3 n0 @2.  吹散细胞入离心管后，离心1000rpm/min*5min；弃上清，加入少量培养基重悬，吹打混匀；貌似LZ忽略了这个步骤；再计数，根据所需浓度吸取不同体积的细胞悬液；4 _  X; D5 J  y. M. B
因为接种体积是48ml，你的考虑是对的，但是可以一个板子一个板子的加(0.5*24=12ml)啊，当然首先要确保细胞在离心管中是均匀不成团的；
8 D6 s7 I! T+ {; @  X7 B" f7 t. N6 m3.  “每铺3-4孔摇匀离心管”----摇匀只是个外力作用，对于内部的细胞并未能完全的吹散，难道你每次从离心管中吸细胞的时候，不是用枪头先吹打几下吗；
2 r6 M6 `6 S: v' D6 F4.  “左右上下稍微剧烈的摇晃培养板”----这个操作我不知该说什么，能确保培养基和细胞能不溅出来？！应该对每个孔用枪吹打吧！