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回复 naturalkillerce 的帖子/ F: M; { E, f9 X2 q
9 ]' C9 @- v0 R4 B还有其他的,供参考:2 W& Z) T5 e: L& A
5 v; C: W& ?1 m- l" X0 B8 P(1)O.D.260 nm(VP/ml), x, E) W3 y0 u. M8 r
这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确,而样品准备过程中又至少要稀释10倍,因此如果 OD值大于0.1,我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒,因含血清培养基会干扰吸光度。同时,它也要求病毒浓度足够高,并且不含缺陷性颗粒。
: K- `9 {5 C2 K" x1 i1. 4℃融化病毒保存液。
0 {7 c$ ~, @! M8 X6 W# `2. 在无菌超净台内用病毒裂解液(VLB)(0.1%SDS,10mMTris PH7.4,1mMEDTH)准备二个病毒稀释度。
0 y, q3 M1 h" s) h) X6 O最小需要量为: s
" y2 M: ?# M* v- m1 F3 ~" k. `; S& [病毒裂解液 病毒 稀释度
& o9 h$ Z/ x$ g k& y52ul 52ul 1:2(稀释液1)
3 p' n, h- r5 [0 @168ul 42ul 1:5(稀释液2), B. ^- u2 [9 a% `0 G' v- j. M
注意:病毒滴度高时(1013/ml)用1:10和1:20稀释度,滴度低时用低稀释度,保证OD值在0.1~1.0之间。
n7 [- t9 h* _$ Y& B3. 56℃震荡培养10分钟。 0 uf'gbjf
5 Y2 S, O& A4 P0 V O7 i& d4. 准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液,比例同上,以缓冲液代替病毒裂解液。) V* E/ E8 `: s, q# d8 R8 j2 }. {
5. 测定260nm处吸光值:
6 x3 Q4 w8 D' K5 R7 S- Y稀释液1再稀释1:5,为稀释液3。6 _: F* {1 Y6 {* L; l+ C
稀释液2再稀释1:5和1:10,分别为稀释液4和稀释液5。
* o0 l) Q% L/ k: T0 W测定稀释液5(2次)、4、3的OD260,取此4值的平均值作为最终结果。
! T( T- u7 b, `0 j+ y& `2 S例如% t" n% j4 f, D2 h' s" ?: Q/ s$ R
1. 将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。8 p/ S1 p% ]7 M* X% i
2. 记下空白管读数后弃去,不要冲洗。
4 Y5 Q6 m3 o5 C6 Q4 H1 H3. 加入450ulVLB和50ul 1:5稀释样本(稀释液2),组成稀释液5。
$ h3 F# N* G: t# {8 m3 ]4. 记下读数后弃去。# [- Z7 N$ L; v- m
5. 清洗比色杯,加入样本重复测一次。8 h) W/ d" M5 n5 U8 J$ z7 p
6. 清洗比色杯,加入400ul VLB和100ul 1:5稀释空白液。 ' o3 ]/ K9 {; Y0 [; Z5 d9 l3 X
7. 记下空白管读数后弃去,不要清洗。
9 V; B0 Q6 ]& S" m8. 加入400ul VLB和100ul 1:5稀释样本,组成稀释液4。7 Z- s' z) V8 j. `
9. 记下读数后弃去。7 E. ^4 U |1 E
10. 清洗比色杯,加入400ul VLB和100ul 1:2稀释空白液。
, \: F! |8 P6 n11. 记下空白读数后弃去,不要清洗。' Y5 b- D! F9 h+ b- V; I, z
12. 加入400ul VLB和100ul 1:2稀释样本,组成稀释液3。* t' t9 A5 K# J. A2 S0 P( m. D
13. 记下读数后弃去。
3 A! X; P1 J' J* ^) |, \将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度:* {9 @9 b6 I) ], `* q8 C- O, B* Q
OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012= OPU/ml
! l6 Q& |' \& F
+ e0 M4 J/ d" s* [(2)空斑测定法
- j% W9 R, h1 a6 ]' o( z* r空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后,通过一个感染周期便可再感染邻近细胞,直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果,因此这一方法得到的结果往往最不稳定。
' m" ~! }$ x$ F8 T; l8 ]1. 5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养,3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿+ Y5 y. Q& g- \& O B% s
。) R! r$ O% m0 @3 |* G
2. 在12孔板中稀释病毒,储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml,其它孔稀释至3ml,大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定(纯化还是未纯化的),调节稀释度至10-100个病毒/孔,一般为10-12,这样稀释比大约为10-7~10-12。
3 z4 u8 V; j `稀释:将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次,此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次,稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%,形成一系列稀释度,最后4个稀释度用于感染细胞。
! F# {. K5 B b! y( g5 W注意:每次稀释时都必须换用新枪头。% ` Q) m7 R7 q, A+ L) l* Z( N0 q
3. 吸去细胞培养液,每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%,十字形轻轻晃动混匀,37℃培养90分钟。2 |" }5 c& v- g% @- h
4. 吸去培养液,按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。( K, \2 _$ l3 q8 |+ C
5. 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。7 S* T; R, X g$ }
结果:计数有多少个独立的空斑形成,将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。. i% O$ F* N' R/ M
, ~/ B# q" X. r7 ~5 j7 h(3) 50%组织培养感染剂量法
( k' s( C$ [+ T1 `此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成,它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。% x! m+ L. K' m" c" Y$ d
细胞准备:0 H' K& O/ R2 L% y1 _+ x
1. 收集一瓶QBI-293A细胞,计数。: B x$ u' E0 X* A, l+ j% z5 A
2. 用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。0 h3 V- L" ?4 M' s
3. 用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
" Z/ \. ~1 V$ A/ Y T. R5.8.3.2 准备稀释病毒液+ b3 [; @$ X! {% T
1. 第1管中加入0.9ml DMEM 2%,其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。2 t" T: h; \0 H. I
2. 上下吸打5次混匀。
0 \' o2 E }1 z3 P3. 换用新枪头。$ r% f8 t5 G- ^7 h: W$ U
4. 从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
2 X# l' @- ^3 D2 T5. 反复稀释至最高稀释度。9 c5 t7 X) X+ s0 q a
6. 用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。
0 r, y; c2 j& {! ~) Z7. 最后8个稀释液加入96孔板,每孔0.1ml,每个稀释度10孔,2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。
9 k- w6 \8 {0 X( I2 t' C" }6 k8. 37℃培养10天。
- ^5 `8 @; Y/ d# `* g& O9. 10天后倒置显微镜下观察,计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性,如果无法确定,可与阴性对照比较。
) p: P! p; ?% ?) z% b: |) M8 a10. 计算每一排中出现阳性的孔数。; X/ ?$ P. y0 B3 a$ ^
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好,最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性,则本测试即为有效。0 ~' Z& ?; [4 f0 \4 L7 s& V9 s0 r
# J2 P. ~, @# K7 l$ F2 Q- A$ g
其实网上资料很多的。 |
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