牛胚胎干细胞分离克隆的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:32 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李松，苗增民，宋文刚，高佩安，江新泉，窦忠英作者单位：1.泰山医学院，山东泰安  271000 ；2.西北农林科技大学国家干细胞工程技术研究中心陕西省分中心,  陕西  杨凌  712100 ；3.山东农业大学动物科技学院  山东  泰安  271000





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      【摘要】  目的  从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。方法  采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养的方法，以高糖DMEM添加0.1 mM2-巯基乙醇、犊牛血清为培养基，以4～13周龄牛胎儿为实验材料，从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。结果  参与胚胎干细胞分离克隆的40例牛胎儿中，一体长6.5 cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到15代；分离得到的牛胚胎干细胞，经碱性磷酸酶染色，体外分化实验，核型分析证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。结论  可以从4～13周龄牛胎儿的原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞。 4 A; k5 }; V( W1 {
      【关键词】牛胚胎干细胞；分离克隆；原始生殖细胞) k9 X! F* Y/ ~7 I
   基金项目：国家自然科学基金（C010902）及国家“九五”重点攻关课题资助项目。
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　　Isolation and Cloning of Bovine Embryonic Stem Cells
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　　LI Song, Miao Zeng-min, SONG Wen-gang, GAO Pei-an, JIANG Xin-quan, DOU Zhong-ying

　　Taishan Medical College, Taian 271000,China
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Abstract: Objective:To isolate and clone bovine embryonic stem cells frombovine fetus’ Primordial germ cells(PGCs).Methods:The bovine ES cells from 4-13 weeks old fetus were cocultured withhomologous fetus fibroblast.The culture system was composed of DMEM (high glucose) supplemented with NBS, o.1mM beta-mercaptoethanol. Results:The number of bovine fetus collected from slaughterhouse was 50. In these fetus,10 ones were contaminated during manipulation .The ES cells derived from a 6.5cm length were continuously passaged (passage 15);. In this study, the bovine ES cells continued to be alkaline phosphatase positive and had the capacity of forming embryoid bodies. Furthermore, they were found to be karyotypically normal and stable. Conclusion: It is a feasible way to isolate and clone ES cells from 4-13 weeks old bovine fetus’PGCs.

Key words: bovine embryonic stem cells; isolation and cloning; primordial germ cells

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　　自Evans和Kaufman（1981）［1］从延期着床的小鼠早期胚胎中分离得到胚胎干（ES）细胞后，早期胚胎（桑椹胚、囊胚）一直成为分离克隆ES细胞的唯一来源。直到1992年，Matsui等［2］以附植后小鼠胎儿的原始生殖细胞（PGCs）为材料，培养得到ES细胞，并首次较为全面证实了PGCs同样可作为ES细胞分离克隆的原材料。本实验目的就是以牛胎儿原始生殖细胞为材料，分离克隆牛ES细胞，完善以PGCs为材料分离克隆牛ES细胞的程序。
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　　1材料与方法

　　1.1实验动物9 m" C9 J5 |8 g
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　　取自西安某屠宰场4～13周龄的新鲜牛胎儿，共用50个胎儿。
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　　1.2主要试剂

　　高糖DMEM、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司、2-巯基乙醇（2ME）。
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　　1.3基础培养液DMEM FBS 0.1mM2ME

　　1.4牛ES细胞的分离常规获取牛原始生殖细胞［3］，并将获得的细胞与同源牛胎儿成纤维细胞共同培养。
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　　1.5牛ES细胞的克隆传代& `( i3 G6 X! K5 h; v# b+ c7 G) t: \
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　　待牛ES细胞集落周围开始出现少许分化迹象即应传代，将该集落与成纤维细胞饲养层一起消化离散后接种在新的培养皿中。) V$ x0 d* M3 y% W" J5 l

　　1.6牛ES细胞的鉴定

　　通过AKP染色、核型分析以及体外分化实验的方法鉴定所获得的细胞是否具备ES细胞的特性。8 B/ ?3 H2 X/ g( T6 P" i$ q! S

　　2结果3 ]/ h& r! e; e
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　　2.1牛ES细胞集落的生长行为及传代后的情况4 T- W6 a  B+ e3 u/ A; E  G2 U' c9 l
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牛ES细胞集落同成纤维细胞一样，在体外有一个逐渐生长的过程。培养12h时，发现有4～5个PGCs组成的小集落，且已贴壁。培养至第7天，出现典型鸟巢状ES细胞集落。此外，还有山包状、馒头状和葵花状等多种形态。集落出现时间与Cherny等报道的相似。实验观察到牛ES细胞集落的形成是PGCs增殖和细胞间相互聚集的结果，同时ES细胞集落之间也发生聚集现象。

牛ES细胞集落离散后，在24h内，就会有部分细胞重新聚集增殖成集落。但此时集落并不典型。培养至48～72h时就会有多个集落出现。待集落较多较大，且又未分化时，及时传代（一般3～4d），就会获得更多的集落。实验观察到，随传代数的增多，呈典型鸟巢状的ES细胞集落也相对显著增多，其它形状如山包状等集落则相对减少。

　　2.2由牛PGCs分离克隆ES细胞的效果- }* g; P4 V/ a9 J/ M# N

　　

　　在屠宰场收集50例4～13周龄的牛胎儿，用其生殖嵴及其周围组织分离ES细胞，并克隆传代，有10例污染，分离得到ES细胞的29例中（72.5%），一体长6.5cm的雌性胎儿ES细胞传至15代（2.5%）。表1由牛PGCs分离克隆ES细胞的效果（略）

　　2.3牛ES细胞的鉴定结果( o. C/ h" |+ U- @1 u2 N

　　2.3.1AKP染色结果牛ES细胞集落和单个牛ES细胞呈红棕色，显阳性；牛成纤维细胞呈黄色或不着色。
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　　2.3.2核型分析结果取13代牛ES细胞进行常规核型分析，结果表明该ES细胞为整倍体核型，核型正常。4 t0 @, n- @( s+ J) C: j- A/ Y

　　2.3.3体外分化实验结果悬浮培养第5天，发现有类胚体状物出现，并见有单个ES细胞形成的囊胚状结构。( H# @- [# s7 ^( W4 I8 b% w

　　3讨论
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　　3.1胎龄对牛PGCs分离的影响3 \2 A$ M# n2 D8 O* z; }8 e

传统认为，分离PGCs只在胚胎的某一特定阶段进行，时间过长当其分化为精原细胞或卵原细胞后，原始生殖细胞则不再存在。然而，本实验从4～13周龄的屠宰牛胎儿中，分离得到原始生殖细胞，并通过培养使其转化为具有胚胎干细胞诸多特性的类ES细胞，这与Cherny等［4］限定的时间相差甚远。与此类似的是，Leichthammer等［5］亦从1～4月龄（体长12～140mm）的牛胎儿中分离得到原始生殖细胞；Shamblott等［6］从5～9周龄的人胎儿的生殖嵴和肠系膜中分离克隆出5个多潜能干细胞系，常万存等［7］在原始生殖细胞迁移至生殖嵴后长达1～2.5月时，不仅分离到原始生殖细胞，体外培养48小时之内原始生殖细胞还转化成了类ES细胞，并成功传至4代。对此现象，笔者认为，性别分化后原始生殖细胞可能只是部分分化为性细胞，未分化的原始生殖细胞仍以干细胞的形态存留在动物体内，因整个内环境，尤其是性细胞分泌因子的负调控作用而处于所谓的“休眠”状态，既不增殖也不再分化。但体外培养时，抑制其增殖的因素消失或是大大降低。因此在性别分化之后，在适宜的体外培养环境下，仍可获得大量的原始生殖细胞。8 L# U& s. S1 K' W
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　　3.2来源于牛PGCs的ES细胞生长特性8 c# H* ~8 n- d/ C6 G# q+ ?
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De Felici等［8］、Leichthammer等［9］、及Pesce等［10］在体外培养家畜和小鼠PGCs时观察到细胞的群集趋向性，并用藻红B染色的方法证实，生命力旺盛的原始生殖细胞多以集落的形式存在。本实验观察到牛原始生殖细胞集落以及由其转化来的ES细胞集落呈明显的群集趋向性，并且发现原始生殖细胞单个状态存在的较少（传代后数小时内的细胞除外），几乎都是以集落的形式出现。这表明本实验得到的细胞具有旺盛的生命力，这种现象在传代的初期表现尤其明显。这可能与采用的培养方式有关。牛原始生殖细胞与同源成纤维细胞共同培养可能给原始生殖细胞创造了一个竞争生存的有利微环境，只有生命力旺盛的原始生殖细胞才有可能在竞争中得以生存。实验中发现，在培养过程中随传代数的增多，集落也越来越典型，更趋向于传统的鸟巢状结构。对此现象，笔者认为这是因为随着传代数的增加，ES细胞集落经历了多次离散，增殖聚合为集落，再离散再增殖聚合的过程，该过程极大的纯化了ES细胞。利用ES细胞聚集的特性，去除了存在于集落中的杂细胞。) U' r) i) x7 r0 `: G; `1 @9 y0 [. d$ O
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　　3.3来源于牛PGCs的ES细胞的鉴定' v. `( B/ L) g( u
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ES细胞和早期胚胎细胞等未分化的细胞表面含有丰富的碱性磷酸酶，该酶的存在是ES细胞的一个重要标志。本实验采用常规偶氮色素法对所得的5代及14代ES细胞进行AKP染色，证实了所得的ES细胞为AKP阳性细胞。ES细胞有别于同样可以无限增殖的癌细胞的一个重要特征就是其经长期传代后，仍能保持正常的二倍体核型，这是ES细胞全能性和多能性的基础。本实验所得的ES细胞经检测核型正常。体外分化实验就是在去除分化抑制物的条件下让ES细胞自行分化形成多种组织细胞类型。本实验在常规体外悬浮培养过程中，出现了单个囊胚状结构，及多个ES细胞聚集形成的类胚体状物。在正常培养过程中，由于饲养层的老化问题，也出现单个ES细胞形成的神经样细胞及类似心肌跳动的细胞团块。
      【参考文献】% W2 B; M5 I* M8 G( N
　　［1］Evans, MJMH, Kaufman. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］. Nature, 1981, 292(9):154-1560 |" T* s; r$ m( T9 n2 S2 {! N
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　　［2］Matsui R,Zsebok, Hogan, Betol. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture［J］. Cell,1992,70(5): 841-847.) k- \% C$ R; t/ y; \

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　　［3］李松,窦忠英,华进联,等.影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究［J］.生物技术通报,2002,158（3）:35-39.

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　　［4］Cherny RA,Merei J.Evidence for pluripotency of bovine primordial germ cell derived cell lines maintained in long-term culture［J］. Theriogenology,1994B, 41:175.4 N( D8 [  b6 l# E' V$ f" b

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　　［5］Leichthammer F, Baunack E, Brem G. Behavior of living primordial germ cells of livestok in vitro［J］. Theriogenology, 1990, 33(6):1221-1230.
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) @4 Y2 a+ p  y  C) B- J

　　［6］Shamblott M.J, Axelman J, Wang S，et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells［J］. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998, 95:13726-13731.
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9 F& G% y2 r: [! |1 U+ n

　　［7］常万存, 窦忠英, 马鸿飞,等. 原始生殖细胞的人类胚胎干细胞的克隆［J］. 西北农业大学学报, 1998,26(6)：105-108.6 y" Z' v: a+ X+ b, k$ O0 `
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　　［8］De Felici M, Mclaren A. In vitro culture of mouse PGCs［J］. Exp Cell Res, 1983, 144: 417-427.

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　　［9］Leichthammer F, Baunack E, Brem G. Behavior of living primordial germ cells of livestok in vitro［J］. Theriogenology, 1990, 33(6):1221-1230.1 |+ E/ b6 W5 I# U* p6 M
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　　［10］Pesce M, Farrace MG, Piacentini M, et al. Stem cell factor and leukemia inhibitory factor promote primordial germ cell survial by suppressing programmed cell death (apoptosis)［J］.Dev, 1993,118:1089-1094.

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