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白血病细胞免疫分型测定3 k1 A. c: ?) p) q: Z' n8 ]$ J
2 X% _# G- C H- ]) C* g4 P A检测原理:
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' C9 h! O7 Q( }: p0 \. ?9 o; \ 利用细胞膜表面所特有的分化抗原对细胞进行鉴别和分型,将免疫酶标技术运用于普通骨髓(血)涂片。可以达到准确区别各种类型血液细胞的目的。本公司采用目前国际上较为先进的免疫组化二步法,并选择国际上被公认的一线单抗和部分常用二线单抗,运用AP染色技术,只需2-3张普通推制的骨髓(血)涂片即可。该法具有灵敏度高,操作简便,试剂用量较少,结果稳定,重复性好,背景清晰,无需特殊仪器(仅用一台普通光学显微镜)、阳性结果保存时间长(便于会诊),整个操作过程耗时仅需2小时即可获得满意的结果。能基本满足临床上对于各类型急、慢性白血病细胞的免疫分型检测。; P. a b/ _& A
9 r& a0 M) B( o$ P* |7 v1 J, G 在血液和骨髓细胞中有一部分细胞含有非常丰富的内源性过氧化物酶,虽然在操作时可采取一些措施来抑制细胞内过氧化物酶,但这种处理比较粗糙,往往不能完全抑制该细胞内源酶的活性,又可造成部分细胞表面抗原的破坏或丢失。而对血液系统中许多恶性疾病的诊断,通常是检测其细胞表面的分化抗原。再则在血液和骨髓组织中,还存在大量的成熟红细胞。其中的血红蛋白对本法也会产生强烈的干扰,(因血红蛋白具过氧化物酶的功能),可对被检8 I8 m( l+ @2 f7 z$ K2 |$ U& e
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标本的背景产生难以去除的非特异性染色。从而导致结果难以判断。所以在血液学中的细胞免疫组化染色,应该首选碱性磷酸酶(AP)显色系统。而尽量不采用辣根过氧化酶(HIP)显色系统。6 `9 G/ C# ]' f
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正常细胞反应:5 Q: c8 ?9 v/ |; N1 d
- ]8 ^8 T9 E' G) B1. T-淋巴细胞------ CD3、CD5、CD7等标记可部分或全部表达,其他系列标记均不表达。
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2. B-淋巴细胞----- CD10、CD19、CD20、HLA-DR等标记可部分或全部表达,其他系列. z" J* x. \7 p" u0 z0 n5 P
: L" ~( h# _7 m; d2 T标记均不表达。
' T% D. p2 j* B' l! t4 n5 |6 ~
' c2 h3 D+ {1 z- p' a7 R% p3. 髓系细胞-------- CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等标记可部分
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; x+ l$ S" Y% D! @ |或全部表达,其他系列标记均不表达。
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巨核细胞-------- CD41、HLA-DR、等标记可部分或全部表达,其他系列标记均不表达。9 f5 l& I/ ]% Z
临床评价 :9 D- B, I- r( Q. D, S, V
! P7 ]/ _( Q* P ~) ?, ]8 s1. 白血病细胞-------若呈CD3、CD5、CD7等部分或全部表达;而其他系列标记均不表达。
: y4 Q, B( H' {* ^& P& \. j4 U' H2 \ N6 W
提示:T-细胞性白血病。% n9 _ j3 Q( n. U2 U+ a! V
, v% O8 w9 z" L; Q D" ~2 i
2. 白血病细胞-------若呈CD10、CD19、CD20、HLA-DR等部分或全部表达;而其他系列标记均不表达。
1 i& E, E+ a; H" E+ p* g" o( U& P$ p/ t6 S
提示:B-细胞性白血病。" T" S4 G* C7 X/ [7 ?
: c/ U1 h" U0 a" j
3. 白血病细胞-------若呈CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等部分或全部表达;其他系列标记均不表达。
3 w x3 X% q- K
! C" |0 u/ t6 [1 F9 R3 N3 n4 f6 m提示:非淋巴性白血病。9 y6 `+ F/ `$ e5 h
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4. 白血病细胞-------若呈CD41、HLA-DR、CD 34等表达;而其他系列标记均不表达。$ F7 }9 ~9 _0 }2 ^% w
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提示:巨核细胞性白血病。
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: g' }, e; }8 v8 e( X" R白血病细胞-------若出现以上1和3或2和3同时表达;其他系列标记均不表达。$ O9 J) ^3 T& H' Q4 U+ \
提示:双表型白血病。
! s e( a) a; `$ f! O/ k/ D1 x' ]- t3 _! Q1 D( P, }1 ]8 m6 d
操作方法:
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1.取干燥的骨髓(血)涂片1~2张。根据单抗检测所需数量用利器将骨髓(血)膜划分成若干小块,每小块约5×5mm左右,小块之间隙为2mm左右并用阻水笔分隔,并作相应记号,置纯丙酮内固定5~10分钟后即刻置于洗涤液内浸洗3分钟/次,三次。% X3 N( l/ h" M# W' j Z( ^, M0 E" s
7 E! n, v2 L2 i" H2.取出涂片,用吸水纸吸干分隔线上之水分,但注意勿使血膜干涸。依次滴加单克隆一抗,湿盒内室温20~25℃放置30分钟,后置洗涤液内浸洗3分钟/次,三次。滴加酶标二抗,湿盒内室温20~25℃放置30分钟,后置洗涤液内浸洗3分钟/次,三次。9 |4 h' U J0 o3 N0 P- u
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3.滴加显色剂湿盒内室温20~25℃放置5~10分钟(可在低倍镜下观察,待阳性结果满意即可),流水冲洗2~3分钟。
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3 y# p8 X, z* x( p2 K" ^4.苏木素复染2~3分钟,流水冲洗3~5分钟。待干后用甘油-明胶封片。镜检。
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9 z2 W7 y" ] i6 q结果显示:
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阳性表达—— 细胞膜或细胞质可见鲜红色沉淀物,细胞核呈兰色。+ |* h; _! `+ a; E& }7 E, G j
0 @" t& A/ z4 q阴性表达——细胞膜或细胞质未见红色沉淀物,细胞核呈兰色。' S0 F; W5 i6 J; t
, N/ t( E3 F9 |0 z注意事项:% O E& B( @; O& `! k
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1.样本应新鲜,但注意须彻底干燥后方能检测(抗凝标本勿用)。通常放置24小时后检测,但样本采集后应在3天内测定完毕。若样本采集后不能及时测定,请勿预先固定和冰箱内保存,否则易使细胞溶解。
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2.样本应选用骨髓(血)膜较长和较薄的涂片为佳,若血膜偏厚,易引起脱膜,影响结果观察,甚至无法观察。
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' i- X6 k( N* N3.划分小块时应选择涂片上细胞分布比较均匀的体部和尾部,尽量避免采用涂片头部因该处血膜较厚不利于结果观察,且容易脱膜。0 t; ~6 ~, U6 k1 k1 X! U5 B" ~) C
$ G% H6 O7 B I* f }4.样本采集后至结果观察完毕前,应避免接触与实验无关的化学物品,特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水等,以免细胞表面的抗原破坏,造成假阴性。
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5.抗体孵育操作不当,可造成背景吸附及阳性细胞呈局限状产生,使结果产生假阳性和假阴性。所以在整个检测过程中自固定后样本均应保持湿润,尽量避免涂片干燥(但是不要留有较多水分以免抗体被稀释使阳性表达被减弱甚至产生假阴性),直至复染后方能使其干燥,以利封片。
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6.滴加单克隆一抗时,格外小心避免小块之间相互混淆,而酶标二抗和显色剂等滴加时无须分开。6 D& ~+ j4 d' _4 E* X
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7.每次洗涤需用染色缸浸洗而且要保证洗涤时间(3分钟/次)与洗涤次数(3次)
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/ y% J; g7 p% ^0 W! x3 D7.苏木素复染后流水冲洗时间可适当延长,以保证胞核被兰化有利于结果观察。
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% p" m4 c1 P+ m7 G8.甘油-明胶封片时可吸取50~80μl封片剂置被检涂片中间,采用24×48mm、厚度为0.13~0.17mm盖玻片,轻轻放下即可,若有气泡可用手轻压盖玻片去除。7 t5 g: x+ Y: J: A$ e4 {
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9.应选择病理性细胞观察其阳性表达情况,若能同时做一张瑞氏染色涂片,对照观察,可进一步提高结果的可靠性。. W- P5 j# t X$ J" O0 P
* Q# Q5 U4 }! ^9 U) k" W9 P10.洗涤液因浓缩倍数较高,常有固体结晶析出,用前置于37℃水浴10min后稀释。! r# k v- m( G1 h; w! |2 r8 u, h
8 y) J8 h. Z* d, Y2 ~7 B3 E) r11.每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。8 k7 X# d- A7 `: ^# K
5 a' q) w8 i+ M& n$ Y0 x常见问题与解决方法:7 @3 Q/ C5 l- L
& X4 t5 k% x6 F0 v& G2 R常见问题% U) c' Q4 g0 q" K1 m
原因* W- ~: {% l& d: Y3 s
解决方法1 N) W8 q/ n' `- v4 e- E# n2 N
未见阳性或阳性减弱:9 ^3 J' J! R1 v1 h/ A8 X/ q8 Q, I
试剂盒过期或保存不当 从新购买试剂盒
/ Y' }0 ]# A2 L( U4 M; Z载玻片未洗净标本被污染 取干净玻片从新采集标本, l: q# ?* `+ }3 W( c
标本放置时间超过3天以上 从新采集标本
/ N$ A' {4 h0 F2 G3 q采用了加有抗凝剂的标本 从新采集标本
; r9 q$ g3 \! N( b标本沾遇其他化学物质甲醇二甲苯、甲醛等 采用未被污染的标本重新染色
- l) i/ B% r& i/ b# r血膜上留有较多水分 需取新试剂从新配制$ Y; \$ j; U( \
每次洗涤时间和次数不够 另取标本和新试剂从新操作
# b5 y) `$ S& ~! `, T9 K6 ^现色剂配制后未及时使用 另取标本和新试剂从新操作# W+ h# W% H. P+ `, k5 A; X# ^
封片前碰到苯类试剂 另取标本和新试剂从新操作
( U3 p) z+ s& h* U孵育时间或温度不够 调整时间和温度另取标本和新试剂从新操作
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/ W0 M% Z/ p8 V$ g染色背景太复杂:( b5 Z! i0 P8 ^, e( f- T
孵育时温度过高(>350C)
+ r: p) k3 S+ c B; }) V* @若影响观察需另取标本和新试剂重新操作& w! ~- k4 W9 r [/ a
背景细胞染色过深 6 v1 T+ W; D0 ~4 L0 p% u) x
显色时放置时间太长,若影响观察需另取标本和新试剂重新操作
: `! z# ^& [0 e$ {) D1 \0 A各种破碎细胞较多 . x9 {9 B; F6 U, ?9 f
无法去除
6 Z4 w9 j/ {$ X0 |. U显色后冲洗时间不够 保证流水冲洗时间. S* O) H* s4 [$ g
复染后水洗时间不够 复染后水洗时间通常为3~5分钟而且须连复染液一起冲洗 |
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