|
- 积分
- 113
- 威望
- 113
- 包包
- 621
|
碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 0 O: k3 d* S# P/ y; e
以ALP为目标物的检测方法：
+ m$ B% S8 _% F. ]. I1 Gomori钙钴法
: n* f8 `! F% q" H+ M- u7 k【染色原理】 3 m h1 a+ n; h: _+ q, k" }
ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 : D; D% a; K% Q& c% m
【孵育液配制】
0 R: X/ p! _5 H4 N3%β-甘油磷酸钠5ml
) z6 z- @+ i5 P% u$ d0 a2%巴比妥钠5ml
: C4 A' J5 M; o j2 c, E: a蒸馏水10ml % H0 o, _9 `' p/ v9 s( O, o% R6 \
2% CaCl2 10ml " Z! m' g3 v# k0 b
2% MgSO4 1ml
+ s0 d; A) u7 }+ T【步骤】 , q& i9 L* ^; y( X$ w
（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 # v# Q z* p/ H4 R5 A; u
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 z1 R& [" G% L) [4 _1 b, G
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 2 a* v* D; A& x" ~7 R$ I0 \
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 $ b" F" Y: } l- `, r+ _1 S
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
0 `# ~1 S) e3 p" r2 t9 R) K( N2 H【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 9 S4 h( F( l0 \& d5 @
2 b y, ^/ v- j& z5 i( h
2 偶氮偶联法： 7 J) s. {0 A) v* q" p1 Z
【孵育液配制】 6 z; j6 C$ x9 W7 ^9 }& Q: I$ \
萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
, p. O9 r% J) f6 c8 I4 N5 r, pDMSO 0.5ml
; a& Q; ^3 R3 p2 w. r0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml 1 [ V& M2 X4 Q2 E X
六偶氮副品红0.5ml
; i; R. M S# }+ C; @2 C+ Y6 M1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
, g$ u, E" @) k（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合） . e9 C b& R% {' o, v) q
【步骤】 5 l4 ]' }+ v" H8 C
（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
, ]$ r, E+ P7 W4 Z9 d3 O（2）蒸馏水冲洗。
5 E T! }3 g, M e Q2 E. [（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 5 ^1 p+ I. T7 g( H
（4）流水冲洗，晾干。 5 `& Q& I$ ?1 U
（5）甘油明胶封固。 ) ^+ A- G. z8 N/ s: [. R
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
. E z# M- O& q
8 F1 ?5 V/ `) A3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： . D! |& _; M3 ?! `. i( Q: O( s
【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 . K# K$ P7 N- Y0 Z" N q! a2 `
【作用液配制】 . X) C* K7 J$ I" f$ |) H; K6 Z
取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。
$ t! q Z! n6 K9 E9 k) Y6 W【步骤】 & O3 @) j/ r+ ]0 H. R
（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。
* l* `( B. M( e6 L. ~4 l（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。
! n) j. B3 |- s5 E; O（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。 a) t! V9 V! |0 \# r' H
【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。
$ u- G! l# b" g Y7 O1 c" a* }/ l, e2 w8 _# \
8 ]: Q7 t7 ~) Z; N* Q
针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：
, a" [+ Z" T5 P" }! `% u$ T# m, N2 I- p( |9 d& c
4 茜素红法
: {! B3 U5 C3 k, f- {1 z- y【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。 4 t0 n9 J4 ]- X' N+ _4 |
【步骤】
) o! `4 W4 \3 b8 J/ g D; A9 v2 g1 E1 P（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。 + k, M+ D5 d% J# I" F' r
（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。
3 J& @7 x7 P5 ~" B* F$ X. q6 x, f（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。 ! D8 W" v, R5 b% S5 W- Q
【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。 0 D# j4 Y& N1 I' k# X% S% r
& I8 h. V: _0 t% D' w
5 von Kossa法
* ]' b. s, X+ T【作用原理】
6 h+ O* q- I- M1 b; u M- C$ yVon Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。 : F' F4 T% z( o5 i3 M( h
【步骤】
7 p7 z" E2 M( ?7 L（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。 ( P8 R5 I# o$ L# m. {9 Y$ l; s
（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。 8 M( \: g/ X! K Y
（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。 # y* I$ O: E6 ]
（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。 0 M$ V3 @" w! i1 w! a# l( u5 G- P
（5）室温下晾干，封固。 |
-
总评分: 威望 + 7
包包 + 15
查看全部评分
|
发表于 2010-11-19 20:27
