饲养层细胞的制备

懵懂干细胞

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。6 D" r# g7 s8 T8 M2 S
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
+ h# T  X+ p+ a3 c8 [直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：
# k( p: m" f0 v" d1 [% I! X3 w! e（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％ 乙醇浸泡消毒。
( w$ V+ w, x4 T/ z$ p（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。
, M% I* ~2 X! v% R（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。+ _5 @& W- d( b5 [0 O' A
（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
3 g+ ?; \% S: B（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。0 S0 ^- p+ r3 B  U! x7 v
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。) L" q7 b9 Q; e5 [3 M& q% C# i
（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。* s$ F2 w1 p: \) |- U1 A0 a" S
（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。2 i7 ]# G  S7 _8 p7 ?
（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。3 d% J' v3 E) |) t% e+ M
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。
  r5 X) v' D& F' W（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

yuhaoze

学习

songyang1987

谢谢分享

llecstem

回复 懵懂干细胞 的帖子/ P( [2 V5 [# a5 F2 v

9 l. l. h% W  _( k想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

懵懂干细胞

回复 llecstem 的帖子* y! o3 s, T: f0 C. \

3 I1 y" M3 w) S- e: a( P2 X这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
3 i# g* c6 C3 b# p+ \  f复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己% h: N' `, U8 t: L
估算一下时间吧。

zdgrp

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

mansnoopy

回复 zdgrp 的帖子+ w# q5 F9 M0 i

/ \( j1 g$ v0 f; y. P/ l肯定是需要用的

mansnoopy

回复 llecstem 的帖子
* B' s' _( n; u# S* w6 s# D
7 }" s. D) I) [这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

igdb

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) c' b+ V7 A  }- H/ a. g
  ?: w( U' w& ?8 N; `2 d第一代不是应记做P0嘛？？

懵懂干细胞

回复 igdb 的帖子8 D8 G( r$ a* L  d% P; `8 `* s
, m( n- F$ I; h" c
是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！ 可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的