干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）
[打印本页]
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-5 10:05
标题:
诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）
最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！
! T& G4 a4 X3 c! [3 \. S5 k1 Q
3 N% q, r" q6 m4 a& P' t# V1 X
1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；
5 g5 }) w6 j5 d8 ]- A
7 M& M7 G* r" \ r8 Q9 G. b
2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；
) B5 |3 D G" O& {8 R
; q* V) g9 b: R" I! |1 A
3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；
' k( q' D6 e! [
& u: F- c: `: {) a
4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····
& ]" h4 t' c* z/ i4 h
]# T. \2 w' `# q& z3 x
5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···
. _' H2 U0 t8 u% _7 w- \0 D8 D2 X
' |7 B" s0 I/ K9 Q, k+ B6 R2 O
补充内容 (2014-12-15 21:46):
) J$ c9 [* j; ~% \
我的QQ：945366086
7 @3 j l7 p! c8 Z& m9 o9 y! {
; [3 F* j o/ Q- D# L8 `. D
补充内容 (2014-12-22 13:42):
# e, ?( R6 q% G; g4 K9 p% N& t
不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因
作者:
zhangweihwz
时间:
2014-12-6 15:53
“发现克隆的同步性不是很好”，限定因子诱导重编程过程是随机性的，所以每个细胞的重编程进程不一致是正常的，不可能所有的细胞同一个时刻出现克隆。
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-6 19:37
回复
zhangweihwz
的帖子
3 G B5 \" T9 P- U# ^4 s
* E) {# P- J8 L# f
能帮助解答下其他几个问题嘛，发表点看法也可以哈！
作者:
zhd0506
时间:
2014-12-8 17:59
回答你第四个问题，第一代手动挑取 形态饱满，边缘清晰并且圆形突起的克隆。
作者:
jojo1988509
时间:
2014-12-9 16:24
唉，我最近也面临这个问题，我开始在饲养层上面挑那种在形态上面看起来很典型的细胞传代，我可不敢打成单细胞，但也没有长起来，有些形态像的不知道是分化了还是本来就不是只是形态像也会分化，不知道是手法还是什么问题，因为后面又发现饲养层支原体污染。
, I" c/ {+ f( x2 n
现在无饲养层的也出现克隆了，我正在纠结怎么办，你之前给有一些做过的经验什么的啊？我这次准备活染了去荧光下面挑去。
作者:
葱葱
时间:
2014-12-9 17:29
可以发一张你初期克隆的照片吗？我也在养，可是挑克隆是我的痛。我用的是无饲养层，我不知道克隆是由于太密形成的，还是就是诱导而成。当然细胞确实长满了。
作者:
陈阳阳
时间:
2014-12-10 17:32
我最近也在做啊，可以多交流。
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-15 21:49
回复
葱葱
的帖子
& Z! i3 m' `/ v8 U, f7 s' z5 \* g
/ P5 Q; f5 p+ Z0 f" n
今天才看到回复，你们可以直接回复我的帖子!
. E9 p0 Q9 R3 V5 P7 ~
' B+ t- F' \# C5 m' [
你说的用无饲养层 是指全程无饲养层嘛（包括无饲养层诱导和培养iPSCs）
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-15 21:49
回复
陈阳阳
的帖子
5 v& @' z: p$ P8 C) G8 u0 }+ K
0 \0 d; Z9 X8 J9 q* a& {, o
欢迎多交流！
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-15 21:51
回复
jojo1988509
的帖子
, x3 G: D! o% a& X9 e' U8 K
4 W' o2 W! f$ b9 y( B, k
也就多挑一些质量好的克隆了，能具体说下活染嘛？
作者:
jojo1988509
时间:
2014-12-18 18:03
回复
Andyhigh
的帖子
, j8 L" B; x6 F6 i* i9 ]1 i
4 z. E+ a1 o7 A! i
Life直接就有卖的活染的TRA1-60、TRA1-81、SSEA4，直接有详细步骤的。
作者:
mecol
时间:
2014-12-18 19:57
回复
Andyhigh
的帖子
/ h: q7 g6 }3 V& s6 h' c; V, z
" t7 K. o6 {5 Q6 e3 e% _1 e; R
请教一下，AP染色后的细胞还可以接着培养并传代吗？
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-18 22:17
回复
mecol
的帖子
* \3 `4 b; [( P+ a% M/ W
' E, }0 X: @/ N
细胞经 固定 透膜后都死了，所以是不照的！
作者:
Andyhigh
时间:
2014-12-18 22:24
回复
jojo1988509
的帖子
& _$ ~6 ^, f6 G9 N" Z- N
! G4 q; V- M! e, k- ^
可有相应的货号哈？
作者:
mecol
时间:
2014-12-19 10:46
回复
Andyhigh
的帖子
; B6 x+ ]7 Q3 z& G. _- I
/ \' @( X; B) @8 c
好的，谢谢
作者:
陈阳阳
时间:
2015-1-2 22:59
1：手动挑取形态比较好的克隆，条件：呈明显突起，致密，消化后传到无feeder的96孔板，用ES+2I培基，然后接着传代至48，24，12，6孔板，最后挑状态好的进行冻存和下一步的实验。
- A) ^, w2 j) x( x+ ]7 ^$ A' I, k
2：iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？
! ]9 ]% Z4 [( }: _: n/ Z S
直接用胰酶消化传代即可。
6 I, G7 [( n; \
3：自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？
- ] u! z, ~, _
克隆的同步性本身就不是一致的，所以不用担心这个。只要有出现形态好的克隆，就可以挑。挑几十株，最后肯定就可以建系的。也可以出现前面的克隆已经建系了，还有的克隆才传到12孔板还没长起来。
7 G. ^ ~+ B$ A% O
甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）； 这应该也是正常情况，你没挑，克隆肯定会分化啊。细胞漂浮，可能是正常的细胞死亡。
作者:
jojo1988509
时间:
2015-1-5 09:25
回复
Andyhigh
的帖子
2 V$ o/ Q9 y9 q' K
+ x, `7 N) o5 W+ U s
不好意思，这久太忙了，LIFE的，41-1000，41-1100，41-4000分别是TRA1-60，TRA1-81和SSEA4的
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5