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标题: 质粒提取不纯 [打印本页]

作者: like_gj 时间: 2013-7-15 15:22 标题: 质粒提取不纯

最近做克隆，提取的质粒测序是正确的，反馈信息说信号不好; W( p0 A9 j; j y R* a
我自己跑电泳时发现总是有两个质粒条带（开环，共价闭合，线型算一个质粒）我需要的是8K
大约在4K左右还有一条2 d. _' _- [) A
然后我用这些质粒重新做转化，挑单克隆，提质粒后发现还是有杂带
请问如何清除这些砸质粒？+ ~/ G3 b7 Q- z# r6 A5 [

作者: like_gj 时间: 2013-7-15 15:26

另外，我用感受态直接摇菌培养- u4 B$ Y4 y6 H/ f
提取的质粒大约40ng/ul (共70ul)，请问这个感受态是不是有问题？

作者: mckf111 时间: 2013-7-16 21:04

like_gj 发表于 2013-7-15 15:26
- }5 N% P; C/ [/ q2 |5 ~另外，我用感受态直接摇菌培养
0 h9 f. v. }+ O5 U) f* z. V提取的质粒大约40ng/ul (共70ul)，请问这个感受态是不是有问题？

- u$ q0 R9 z- N
感受态应该是空菌不含质粒应该考虑重新购买了

作者: Dancmacabre 时间: 2013-7-23 22:58

40ng/ul，这个质粒的OD值很低。建议你直接菌种划线，最好挑几个单克隆做下PCR检测，接阳性单克隆于试管在摇床培养。最好分析一下该质粒的基因序列，如果是你自己构建的克隆，你要弄明白它的功能区里面是否插入致死因子编码区，或者有其他增强型的表达蛋白，有可能会决定你的质粒拷贝数很低。至于有一个4K条带，那可能是断裂的DNA片段，你可以做一下PEG纯化，若效果不明显，只能做胶回收。

作者: chenhuachen 时间: 2013-12-6 17:55

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

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