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标题: PCR克隆基因酶切的问题 [打印本页]

作者: daviddow 时间: 2012-7-5 00:19 标题: PCR克隆基因酶切的问题

如何解决酶切后没有条带的问题？
PCR产物：N422 R! G1 ?5 a5 r, D

; g0 d- K% }! w/ {, l
酶切后：PCR-N4-BamH

0 q; y$ k& R4 M. C% A
酶切的条件是：
Nuclease free water    40ul4 ?# n: A( A# P& b- F
BamHI Buffer       5ul3 _: O: A7 j& D5 v. g) L2 [
PCR product          ul' c) t1 F* o' Q2 f: ^3 f! t( p
BamHI             2.5ul
HindIII             2.5ul
②: mix gently and spin down for a few minutes;
③: incubate at 37°for 3hours

作者: 刘森泉 时间: 2012-7-5 08:05

通过酶切其他载体检测酶是否有问题；通过PCR检测载体是否有问题；第三就是酶切反应了，这样的体系一般没有问题，因为你的BamHI Buffer不适合切HindIII，至少单酶切可以成功，一条条带至少应该有。

作者: 风雪叶杰 时间: 2012-7-5 08:42

酶切之后没有条带？建议先检测下酶的质量问题吧，还有buffer。就算切不开也不至于把片段弄没了，只有可能是降解了，这两个酶都挺好用的，不会有什么大的星活性

作者: b6122 时间: 2012-7-5 09:56

本帖最后由 b6122 于 2012-7-5 09:58 编辑 8 I2 T+ X* ?6 P+ N2 }5 u; I  y

我切bamhi和hindiii的时候用的neb的buffer 2 （10x），我在网上搜了一下，配方如下：
1X NEBuffer 2:
50 mM NaCl
10 mM Tris-HCl7 v/ e* t; M. d* J: |
10 mM MgCl2
1 mM Dithiothreitol& |; e- a  O. F4 H& P
pH 7.9 @ 25°C5 T6 c# C, |5 S
这个buffer条件下，两种酶的活性都最高4 c1 l3 H/ p  ~) x$ S1 c# l1 T  c( r' _1 |

另外，你pcr产物跑电泳后回收胶有没有问题？

作者: daviddow 时间: 2012-7-6 06:50

b6,你说的回收胶有什么问题？不知道什么意思？谢谢！我是沉淀了一下就酶切，没有跑胶。

作者: daviddow 时间: 2012-7-6 06:52

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我的是fermentas公司的内切酶，这是他们推荐的内切酶。我切了质粒以后没问题，但是PCR酶切后就没有我需呀的条带了，都到了100bp一下了

作者: daviddow 时间: 2012-7-6 06:55

回复风雪叶杰的帖子

谢谢风雪，不知道哪些可以降解PCR产物？我的质粒没有问题，就是PCR产物都降解了

作者: lazyworm 时间: 2012-7-6 08:31

即使酶切没切开也应该有一条带吧，一点东西都没有要考虑前面的实验是否成功了。

作者: youzi821 时间: 2012-7-6 12:41

回复 daviddow 的帖子
- n& d2 I! v0 g6 \2 `+ K& ]: b1 l
fermentas的酶，你看下酶的最适孵育条件和时间，超过30分钟，BamHI有其它活性，最近我也遇到这个问题，把酶切时间缩短，如果是快速酶的话，15分钟左右就可以，不要孵育那么长时间。

作者: youzi821 时间: 2012-7-6 12:43

而且一般情况下双酶切需要用通用buffer，请按照你买的试剂公司的条件来做。

作者: linzi214 时间: 2012-7-6 15:15

首先要检测一下PCR产物有没有扩增成功，将PCR产物凝胶电泳纯化回收后再酶切；另外酶切位点是不是特异的，会不会有多个酶切位点呢？酶切后得到的片段多大，会不会凝胶浓度太低或者电泳时间太长跑出去了？

作者: runsong 时间: 2012-7-6 19:31

是你的PCR产物加得太少了

作者: daviddow 时间: 2012-7-7 03:06

回复 youzi821 的帖子
q, m4 w8 j8 W
谢谢youzi821了。我的buffer是网站上介绍的，就是用BamH1 buffer.

作者: daviddow 时间: 2012-7-7 03:09

回复 linzi214 的帖子

PCR产物正确，我没有纯化，就是沉淀了一下，然后开始酶切。根据NTI VECTOR没有发现有其他的酶切位点。酶切后1200bp. 琼脂让电泳么有跑出去，就是都酶切了。

作者: daviddow 时间: 2012-7-7 03:09

回复 runsong 的帖子
3 \7 M5 g1 \8 ?$ r, c; |
1200bp

作者: zxcv12345 时间: 2012-7-7 06:47

回复 daviddow 的帖子' Y9 B+ P) c$ _5 b* H4 q* k0 G

感觉是你在沉淀过程弄丢了，, W; k6 P! F% J: `
建议先不沉淀，直接电泳看看。6 s, u% K. n4 O% D6 s( C& G3 [+ c

作者: lcxlorna 时间: 2012-7-7 17:43

在做酶切之前应该先跑个电泳确定PCR产物有没有，浓度多大。另外，两种酶如果不是共buffer酶是不能同时切的。即使同时切也应该有一个条带，PCR产物也应该有条带呀？是不是电源插反了或者胶放错方向了，有人犯过这种错误。

作者: linzi214 时间: 2012-7-9 21:12

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PCR产物的量够多吗？因为纯化会损失。我们一般酶切至少扩50ul体系，切胶纯化后全部用来酶切。切胶纯化一来可以看扩增产物量够不够，其次还可以去除其他非特异的条带（因为是整个基因组作为模板，多少会有些非特异扩增的，即使你看不到条带）。酶切回收次数越多，产物会损失越多，所以一开始就要保证有足够的PCR产物用来酶切。

作者: weiyepan 时间: 2012-7-10 02:17

你酶也加太多了吧，PCR条带很浓么？两个都是有星活性的酶，减少到1/5用差不多，而且体系这么大，看不到条带很正常。。。

作者: daviddow 时间: 2012-7-13 08:39

回复 weiyepan 的帖子. S- q8 J$ g0 K* I/ F4 s0 T

谢谢wei，我下次按你的建议做做，谢谢

作者: daviddow 时间: 2012-7-13 08:40

回复 linzi214 的帖子$ R# i, Y* R5 s* i& c
1 Q! N9 w# B6 b9 o- \; a8 a
我也用的是50ul的反应体系，谢谢你的建议

作者: c05241037 时间: 2012-7-17 09:44

没有目的条带只有100bp的？这个大小应该是引物二聚体，没有出现弥散条带的话产物降解可能性非常小，降解通常会出现彗星感smear，你有没有跑PCR产物？建议跑胶PCR产物。

作者: daviddow 时间: 2012-7-18 00:04

回复 c05241037 的帖子. t9 \4 y1 ]7 w' O$ x

我跑了，是1200bp，很好。就是酶切以后，出现了问题。

作者: c05241037 时间: 2012-7-19 10:42

给你说说我以前的克隆吧，
PCR 体系50ul、30循环，7 S3 P1 z$ k k& D B2 m
PCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，+ {( a! U5 I8 p' g9 x7 M% H( l
双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul Z4 Z4 \# S$ d
一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验- `- U" F0 q0 ?
我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

作者: c05241037 时间: 2012-7-19 10:43

给你说说我以前的克隆吧，
PCR 体系50ul、30循环，
PCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，
双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul
一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验2 H8 Z# @+ H1 W( J+ E3 a9 M$ L- q
我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

作者: daviddow 时间: 2012-7-20 10:29

回复 c05241037 的帖子1 n* {! ~! M" g5 ]; r3 K0 \4 m+ Q3 ^
/ k6 v) ?* l& ?/ n, q# @* ?0 o
谢谢c05241037 ，不知道你用的内切酶是哪个公司的？

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