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标题: 错在哪一步，望赐教！-------谈脐血分离EPC [打印本页]

作者: 542177563 时间: 2012-5-11 21:37 标题: 错在哪一步，望赐教！-------谈脐血分离EPC

具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白膜层不是很明显）---PBS洗两便---一部分养在DMEM中想得到MSC，另一部分养在EGM中为了得到EPC（用的是培养瓶，没有铺胶）------可三天后换液（换液时没有发现贴壁的细胞）------换液2天后发现瓶中仍没有贴壁的细胞。结果什么也没培养出来，步骤中哪一步错了，望赐教！

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-20 15:56

接种的密度如何，EPC是密度依赖性的，密度低了不长

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-20 15:56

另外EPC最好要用FN coat一下

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-20 16:02

吸取白膜层（白膜层不是很明显），这一点说明你离心效果不好，注意到离心的细节了吗，我所在实验室他们脐血分离MNC时，离2次心，第一次20分钟，第二次10分钟，白膜层很清楚，而且离心时要采用SLOW SLOW，慢加速，慢减速，况且稀释血液时你的比例是多少，自己摸索过吗？1:1，1:2，还是2:3，3:4？自己不仿按我说的做一遍，看哪种离心效果好，下次把我做的病人的外周血离心后的照片传上来发给你看看，其实还是蛮清楚的。

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-20 16:04

另外你是怎么吸取白膜层的?吸取上层血清距白膜层多少时你停止？

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-20 16:06

建议2天后半量换液，4天后全量换液，早期RBC比较多，会对EPC有影响，况且EPC48小时内基本都贴壁了，当然换液时一定要小心，尽量少晃动培养皿和培养瓶。

作者: 542177563 时间: 2012-5-20 22:46

回复穿越地平线的帖子9 o6 N3 e. h7 k0 z0 h. v6 z; w1 p. u

呵呵，不好意思，我现在还在摸索中，我最近又做了一次，没有红细胞裂解液，直接把抽来的脐血稀释两倍（脐血：PBS为1:2），然后铺血进行密度梯度离心（Ficoll：脐血为1:2），在20℃，400g，30min下离心，结果能看到模糊的白膜层，但夹杂着红细胞。吸除上清层（没有注意离白膜层多远），吸取白膜层后加大量的PBS洗涤。结果培养几天还是没有见到贴壁细胞。你能发给我一份你的试验详细步骤吗？我的邮箱542177563@qq.com，万分感谢！

作者: 穿越地平线 时间: 2012-5-21 11:48

好的呀，我有空晚上发给你

作者: zz091115 时间: 2012-5-21 14:52

Ficoll的量太少 1:1左右的比例比较合适其次离心机要缓升速缓降速离心时间大约20-30min 15ml的离心管效果比50ml的要好原因我解释不清楚可能和液面接触面积有关系接种密度要大点板子还是需要铺下纤连蛋白还有就是你有没有注意你的Ficoll是人用的还是鼠用的这两个密度是不一样的

作者: 542177563 时间: 2012-5-21 17:17

回复 zz091115 的帖子" ^( j: X2 t# X+ e% P8 c0 h
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谢谢提醒，我原本打算做小鼠骨髓的，所以定的是小鼠的Ficoll液，做了之后发现小鼠骨髓中的EPC很难养，几乎没有任何成功，就转成做人的了，看来我要换一下Ficoll液了！还有EPC是不是一定要铺层？我一般用的是培养瓶，听说瓶底一般有铺层，有时最多用多聚赖氨酸铺一下罢了！这对培养出EPC细胞的影响大吗？

作者: 542177563 时间: 2012-5-21 17:18

回复穿越地平线的帖子4 O* ]# X i8 M3 j7 W

先谢了！

作者: zz091115 时间: 2012-5-25 16:07

回复 542177563 的帖子

纤连蛋白还是别省了我没做过对比但是貌似有不小影响小鼠骨髓效果是不太好我之前也碰到过还有和你小鼠有关老鼠周龄短自然才好做

作者: 542177563 时间: 2012-6-6 23:55

回复穿越地平线的帖子5 c* b7 b3 N) z- G: ^! ~
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看到你培养出的EPC克隆团图片很漂亮，请问是用成人外周血分离+fibronectin涂层培养出来的吗？培养几天得到的？

作者: almasun97184 时间: 2012-6-7 17:04

脐血不能先用红细胞裂解液再密度梯度离心。你做的这一步是为了什么啊？Ficoll的说明书也不是这么写的啊。直接稀释了离心就行。
脐血稀释倍数和血液Ficoll的比例不是特别重要，有点出入关系不大。1：1到1：2都可以。
离心时的加速度确实非常重要。必须为0。移动的时候也要很注意。: k8 D) N% |- n
FN还是铺了好，影响不小。没有FN，出来的克隆又少又小。

作者: realinter 时间: 2012-10-19 13:39

回复穿越地平线的帖子

同求步骤啊scylc@163.com
另外，EGM-2培养基怎么使用啊，给了很多补充试剂包括EGF,FGF,VEGF ，vc，FBS什么的，是全部加进去吗，还有FBS在 kit里面只有10ml ，要另外补加到10%吗，谢谢

作者: quit6927 时间: 2012-11-5 13:08

542177563 发表于 2012-5-11 21:37 : [) A, A8 z" f7 M& P' w
具体步骤是：脐血稀释---红细胞裂解液裂解稀释后的脐血---取上清液-----再用密度梯度离心----吸取白膜层（白 ...

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铺板是必须的。不知道红细胞裂解液处理会不会影响MNC活性，我们直接生理盐水稀释然后就ficoll离心。我们的经验，脐血的分离效率也是很低的，几十ml也就1、2个克隆。

作者: evial 时间: 2012-11-5 14:29

你太有才了，将红细胞裂解法和梯度离心法合二为一！本来外周血EPC就很少啊！洗来洗去的说不定就洗没有了，哈哈

作者: coffee.cat105 时间: 2013-4-17 15:05

本帖最后由细胞海洋于 2013-4-18 09:36 编辑
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回复穿越地平线的帖子
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能发一份给我不？我们正要开始做，想要一份详细步骤，万分感谢，

作者: PercyLaw 时间: 2013-4-17 21:19

另外，密度梯度离心Ficoll液：血液的比值是在离心管中高度的比，尽量两段都长一点，加血液的时候一定要慢，离心力宜小不宜大，时间长短可以自己摸索一下。而且有的朋友说，Ficoll液的厂家和质量也决定了白膜层的清晰度和分层情况。) i# H4 `" L- {7 i1 B: U
我个人感觉还真是不需要红细胞裂解的，直接在ficoll液中加稀释的血液应该就可以。

作者: PercyLaw 时间: 2013-4-17 21:21

个人认为，EPC这种细胞还是比较少而且娇气的，所以洗细胞可以试试用培液（不加血请的，最普通的那种，1640也可以），对细胞的损伤会比较小。

作者: 小公 时间: 2013-5-28 08:06

回复 PercyLaw 的帖子1 c$ A5 v/ ]$ [- c6 `

你好，我也是分离脐血单核细胞，先用羟乙基淀粉沉淀红细胞，后用ficoll 分离，密度 1.077，白膜层总是混有一些红细胞，

作者: PercyLaw 时间: 2013-5-31 11:31

回复小公的帖子
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这个我是这么认为的，首先，我试过万汶，感觉效果不大好，不知道你那里做出来怎么样，它沉淀红细胞的效果是有的，但不那么好。后来我试验室的教授说试试明胶，效果就出人意料了。可以试试。

作者: zxmflying 时间: 2013-7-3 12:34

本帖最后由 zxmflying 于 2013-7-3 12:36 编辑 . m. Z C5 V' v) M3 {

你太好了！

作者: echo666 时间: 2013-7-10 09:46

回复 542177563 的帖子. C0 I% Q+ w. [4 s+ w* S6 I, G# y

我们也养这个，要等到第4周才会出现EPC的增殖。

作者: simed 时间: 2015-7-13 21:33

回复穿越地平线的帖子# j8 e4 ?5 [ n2 l. k

请教下外周血分离EPC做法？我尝试了很多次都是分离效果很好却没贴壁

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