作者：秦雅鑫，宋琦，殷樱，许川山作者单位：重庆医科大学附属第二临床医学院康复中心, 重庆 400010 ) ]7 B5 R! g. y % e3 ~& J$ ^2 J7 u/ P6 H
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【摘要】 目的： 利用小鼠胚胎干（ES）细胞分化成神经前体细胞模型，研究极低频率电磁场（ELFEMF）对细胞周期调节基因、凋亡相关基因以及细胞增生和凋亡的影响. 方法： 分离、培养和诱导ES成神经前体细胞，于诱导后第4日起，实验组予ELFEMF干预，对照组采用假暴露，于4 4 d, 4 7 d，4 11 d，4 17 d，4 23 d使用BrdU和Nestin免疫荧光染色检测细胞生长分化，RTPCR检测bcl2，bax，GADD45基因转录产物水平. 结果： 对照组和实验组的BrdU和Nestin免疫荧光染色未能发现细胞生长和分化有明显改变，对照组和实验组的RTPCR检测发现，在4 11 d时bcl2和bax mRNA 表达升高(P& Q7 s$ n( i& E% U
【关键词】小鼠; 胚胎; 干细胞；低频率电磁场；基因, bcl2；bax；GADD45 7 I, k8 W5 M% w6 X, S0 N Effect of electromagnetic fields on transcript levels of apoptosisrelated genes in embryonic stem cellderived neural progenitor cells " Y2 G" O% |" h2 W ? " V' C; c6 }! v4 s0 y$ L QIN YaXin, SONGQi, YIN Ying, XU ChuanShan: e( ^8 l5 A' K% ?7 Y! F# l
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Rehabilitation Center, Affiliated Second Clinical Medical College, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China! I" B6 C8 |4 m% s
( v4 m6 M1 h6 l. c& P' T 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of electromagnetic fields on the cell cycle regulatory gene and apoptosisrelated gene and on cells proliferation and apoptosis with the model of mouse embryonic stem cells (ESCs) differentiated into neural progenitor cells. METHODS: ESCs were cultured and differentiated into neural progenitor cells; after 4 d of differentiation, the experimental group was exposed to extremely low frequency electromagnetic fields, while the control group was shamexposure. Immunofluorescence of BrdU and Nestin was used to detect the development and differentiation, and RTPCR was applied to detect the changes of transcript levels of bcl2, bax, GADD45 gene at the day (4 4), (4 7), (4 11), (4 17),and (4 23). RESULTS:No significant difference was found in the experimental and control groups in cell growth and differentiation. ELFEMF induced upregulation of bcl2 and bax at d (4 11)(P + C0 j4 }* c* f4 h& y. J3 m8 a1 e1 L$ E
【Keywords】mic embryo; stem cells; low frequency electromagnetic fields; genes bcl2; bax; GADD45 & e5 q7 m, B) C* j& U, X( g; J" m; R; @2 h0 E% m8 J. ~1 Q6 t2 T
0引言 1 B9 k4 j7 i: i1 g/ S8 L4 \& T) M, r9 ^; x6 K5 h# X
多能胚胎干（ES）细胞可以分化成三个胚层的特异性细胞. 在分化的过程中，ES细胞再现了早期胚胎的发育过程，因此这提供了一个极好的体外分析遗传和环境因素对细胞分化影响的模型［1］. 极低频率电磁场（ELFEMF）指频率为0～300 Hz的交变电磁场，电磁场对生物体作用的研究已比较广泛，虽然大多数研究结果存在较大差别，但是磁场对肿瘤（肿瘤被认为属于干细胞疾病）的影响已经有比较一致的结论［2］. 神经干细胞在没有形成大量的化学突触前，由于大量电突触的存在，细胞间直接的电流活动，很可能通过外加磁场而影响细胞的信号通讯，甚至可能改变细胞的发育、迁移等. 本实验我们研究ELFEMF对细胞周期调节基因、凋亡相关基因以及细胞增生和凋亡的影响.+ F) }0 u' {+ I4 q/ I
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1材料和方法 8 t+ Q3 j! p5 R" T4 F 6 D- g2 ^5 H: F$ S9 I8 r4 ?3 ~( A6 f4 I" f: G/ [3 R0 P
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1.1材料 2 K8 Q) R1 ~4 a" \' h; I3 }, T 4 O" ?5 U8 R% O, y' c: P/ [ 取孕3 d母鼠囊胚. 在实体显微镜下先将变性或不正常的胚胎剔除掉，然后再将正常的囊胚和桑椹胚转移到饲养层上，置培养箱培养4 d，形成拟胚体（embryoid bodies, EBs）. 将EBs置于在含有胰岛素（insulin）、转铁蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纤连蛋白的无血清DMEM/F12培养液中，将细胞密度调整为（0.5～1.5）104/cm3的小鼠ES细胞培养置于1 g/L明胶包被的组织培养皿上，使用含有 N2和B27的神经细胞专用培养基 Neurobasal（Gibco公司）在37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养细胞. 培养至第4日，60%以上的细胞分化为神经前体细胞，进行射频电磁场辐照. ELFEMF分为实验组和对照组，于第4 4 d，4 7 d，4 11 d，4 17 d，4 23 d（4为从开始培养计时）分别使用免疫荧光细胞计数和RTPCR检测.! S5 o. ]4 ?, o
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1.2方法+ S2 Q3 M# }- }6 Q4 d9 S# _$ D0 a
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ELFEMF辐射频率选用50 Hz 电力线，2.0 mT，采用5 min开/30 min 关的间断模式于4 4 d时分别辐射48 h；将培养分化至4 d的神经前体细胞随机分为2组，放入射频辐射系统的波导腔内，实验组进行上述辐射，对照组不输入射频信号，进行假辐射. 整个辐射过程中，细胞处于37℃，50 mL/L CO2的孵箱中，温度变化不超过±0.1℃. 7 v) t3 B* }4 A" ^: x9 t / x7 E4 V ~* T8 k T 1.2.1免疫荧光染色和细胞计数细胞分化后4 d进行免疫荧光染色，选取部分上述的细胞克隆种植于24孔培养板，每组各6孔. Nestin免疫荧光染色检测Nestin免疫反应阳性神经组细胞. BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入上述的细胞克隆（BrdU终浓度为 5 μmol/L）中，培养24 h. 每孔加入40 g/L多聚醛(4℃) 固定20 min，30 mL/L H2O甲醇孵育15 min，去除内源性过氧化物酶. 加正常山羊血清封闭30 min，用抗BrdU mAb (Sigma) 分别进行免疫荧光染色，染色结果用倒置荧光显微镜观察并用佳能数码相机摄片. 病理彩色图像分析系统对各组免疫荧光染色切片进行图像分析. 荧光显微镜在一个视野放大200倍镜头下计数，用图像扫描分析仪分析.. e7 i- t2 Q7 J: `" ^ v3 m8 W
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1.2.2RTPCR检测bcl2，bax，GADD45基因mRNA表达水平实验分组如前所述，经处理因素作用后，分别搜集各实验组细胞，用一步法试剂盒(TaKaRa One Step RNA PCR Kit） 检测bcl2，bax，GADD45基因表达水平，首先利用Trizol试剂 (Gibico BRL）提取细胞总RNA，分光光度计上测定其在260 nm和280 nm的A值，计算RNA的浓度和纯度. 根据NCBI中cDNA序列设计引物以βactin mRNA作为检测的内参照，PCR反应引物由大连宝生物公司合成. 选用一步法试剂盒进行单管RTPCR，按下列组成配置RTPCR反应液，反应总体系为50 μL：10One Step RNA PCR Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)10 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 5 μL，RNase inhibitor (40 U/μL) 1 μL，AMV RTase XL (5 U/μL) 1 μL，A MVOptimized Taq (5 U/L) 1 μL，上游特异性引物(20 μmol/L) 1 μL，下游特异性引物 (20 μmol/L) 1 μL，RNA sample (≤1 μg) 1 μL，RNase Free dH2O 24 μL.按下列反应条件进行RTPCR：50℃ 30 min RT反应，94℃ 2 min RTase失活，然后以94℃ 1 min，55℃1min，72℃ 1 min，循环1次；94℃ 1min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min. 取10 μL样品在20 g/L琼脂糖凝胶电泳90 V 40 min，用DNA Marker DI2000 (TaKaRa）作为分子量标记，自动电泳凝胶扫描分析系统(Chiem Image 5500) 扫描凝胶并进行定量分析，分别测定bcl2，bax，GADD45以及βactin的平均光密度值 (IDV)， 以bcl2/βactin，bax /βactin，GADD45/βactin表示bcl2，bax，GADD45的表达水平. PCR反应引物序列见表1. 表1RTPCR引物序列及扩增片断长度（略）- e+ M: z# ^) [2 \, Q9 y$ o5 z0 k
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统计学处理：计量数据均用x±s表示，使用SPSS13.0统计软件包进行分析，组间比较用 t 检验，P 3 n! [4 x4 v1 L8 K9 A9 X1 e# Z4 i% {- S& H$ r4 O' u
2结果 " ?8 ~, g7 q" }% | 0 U `! D/ Y3 k" B) Y* z 2.1ES分化为神经前体细胞胚胎体在DMEM／F12无血清培养液中培养，72 h内细胞大量死亡脱落，存活的细胞为神经前体细胞，其形态多数变为细长形，有较为明显的突起，细胞之间可以见到突起联系交织. 取细胞作Nestin免疫组化染色，80％以上细胞为阳性. BrdU特异性标记细胞核，细胞团打散后，可观察到大量BrdU标记阳性的干细胞，说明这些细胞具有增殖性的神经前体细胞（图1）.1 S/ T2 l( c$ j7 ^. S* [
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2.2ELFEMF在各时间点BrdU阳性细胞数比较 + ?& B( K# B f3 Q+ `( a2 }5 {) a0 c7 `( T0 g5 T
对EMF和假EMF暴露组的细胞免疫荧光分析表明，表达神经元或星形细胞蛋白的细胞数量无统计学差异（P>0.05，表2 ）. 表2ELFEMF在各时间点BrdU阳性细胞数（略）2 n5 k' T+ p9 }; Y+ v7 Q- @" }
4 D2 b4 j- D8 o7 Z! Y% k- r 2.3ELFEMF对ES源性神经前体细胞bcl2，bax，GADD45基因转录水平的影响 : [! [3 \6 I0 o7 K/ ], i+ B4 W) K 0 ] o) d+ K# B, e) c @2 @: R- m βactin，bcl2，bax，GADD45 mRNA RTPCR结果显示，在4 11 d时bcl2和bax mRNA 表达水平高，与对照组比较，均有统计学差异（P' u$ S$ ]6 F! \0 j& r
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3讨论% J: \: f$ E, y: z9 K! }
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ELFEMF有着广泛的生物学作用，并有可能影响基因表达进而影响细胞的分化而产生各种疾病［2-3］. 我们利用ES分化模型，检测ES源性神经前体细胞在暴露于ELFEMF时，各种调节基因在转录水平的特异性变化.! _0 [) z) p& N, b
& C2 b _! M" m) k. u Nestin的表达始于神经胚形成时的神经细胞内，是早期神经上皮细胞的标志，已被广泛应用于神经干细胞的鉴定［4］. BrdU是胸苷的替代品，在细胞分裂前的DNA合成期作为底物，参与DNA的合成. 所以BrdU标记的阳性细胞是具有增殖性的，而且BrdU只标记具有增殖能力的细胞［5］. 我们对诱导4 d的ES细胞进行Nestin和BrdU染色，在ELFEM的对照组和实验组中均发现有Nestin和BrdU免疫荧光阳性细胞，说明培养的是具有增殖能力的干细胞. * s, h3 K1 n- H8 Y9 m% [& m) t- F/ U ) O2 O5 e+ @& g' k# p; I- F Bcl2是一种原癌基因，是人类滤泡型淋巴瘤的细胞遗传学标志，具有阻断程序化细胞死亡的作用［6］. Bax基因是Bcl2家族成员，与Bcl2形成异二聚体复合物. Bax表达并不阻断凋亡，而是具有对抗Bcl2蛋白抑制凋亡的作用. Bcl2/Bax的比值对细胞接受刺激后存活有关键作用［7］. GADD45是一个具有细胞生长阻滞和DNA损伤作用的基因，也是第一个被检出的p53下游靶基因. GADD45通过p53依赖及非依赖两条途径参与细胞周期监测点、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动的调节，在维持基因组稳定性中发挥重要的功能［8］. C) K% F: y$ K/ n. A$ a 8 n* y# s C/ g5 J6 u. R$ z 7 c4 h7 M% n* a+ y2 F; n1 v, i8 I
ELFEMF显著地上调bcl2家族两个功能相反的基因bcl2和bax mRNA水平的升高，由于抗凋亡基因bcl2水平相对于促凋亡基因bax只是略微升高，我们不能说ELFEMF显著地引起神经祖细胞凋亡. 免疫荧光和细胞计数未能显示在暴露或“假暴露”于ELFEMF时细胞核有显著的凋亡. GADD45在转录水平的下调表明可能有轻微的细胞增生刺激作用. 然而，整合入Nestin阳性细胞的BrdU未能表明暴露与EMF的细胞有增生的迹象. 我们没有发现神经元和神经胶质细胞特异性转录产物和蛋白数量有改变，这说明暴露于ELFEMF不会影响神经细胞分化过程. 8 x# l" _! ?) @
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+ X& @. h$ T2 u" Z# t- g$ U* ^ $ _1 V9 Y7 G G0 N! f+ a0 Z5 s- v EMF信号可以引起体外ES源性神经祖细胞的细胞周期调节和凋亡相关基因在转录水平的改变［9］. 然而，由于缺乏EMF对细胞增生、凋亡影响的证据，我们推测在转录水平mRNA的改变会逐渐地在翻译水平和反应后阶段被代偿，因此不能引起可检测的细胞生理上的变化. G- Y! [& ^+ Z 【参考文献】 ; Q1 c1 H) O* ^ ［1］Wobus AM, Guan K, Yang HT, et al.Embryonic stem cells as a model to study cardiac, skeletal muscle, and vascular smooth muscle cell differentiation［J］.Methods Mol Biol, 2002, 185:127-156. $ g2 u* u' k) q; X/ O2 ?7 e& W1 u$ e. M
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