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标题: 取小鼠原代MEF消化时间是多少？？？ [打印本页]

作者: luyoude 时间: 2010-3-30 10:31 标题: 取小鼠原代MEF消化时间是多少？？？

我用13.5天的小鼠胚胎做MEF 37度胰酶-EDTA消化15分钟，结果第二天细胞全死没几个贴壁的。是不是胰酶消化时间太长了啊？？我看文献资料上很多都说胰酶消化10多20分钟啊！！各位高手你们做MEF的消化时间是多少啊？想看看大家的经验。。。

作者: wuxiao101325 时间: 2010-3-30 11:07

一般5min就可以了，建议参见http://www.stemcell8.cn/thread-16869-1-1.html

作者: starlight 时间: 2010-3-30 11:57

昨天刚做了两只小鼠的原代MEF，我的做法是：组织块剪碎后，放入20ml血清瓶中，加入10-15ml 0.25%的胰酶，轻轻吹打，然后放入孵箱消化沉降5-10min，这是第一次消化；消化后吸取上清，加血清中和，离心，离心下来如果血细胞过多，舍弃，如果MEF细胞量还可以，种到一个瓶子里；吸取上清后，加15mlD-hanks，吹打，沉降，吸上清，接下几次细胞都较多的，如果细胞比较少了，组织块还比较大，继续加胰酶消化下；我觉得不可用胰酶消化过长，否则对细胞损伤太大

作者: ellapan 时间: 2010-3-30 13:08

一般来说胰酶消化时间的选择上虽有一定的要求但是像你这样细胞都死光光啦我个人觉得不单是消化的问题了

作者: 科学家 时间: 2010-3-30 14:54

可以在37°缩短消化时间，或者就在室温消化8-15分钟，消化过度会影响细胞贴壁和生长的

作者: 上海过客 时间: 2010-3-30 16:44

发个图看看什么问题。
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我觉得那细胞还挺皮实的。开始消化下来的细胞好像有文献报道不太好。
剪碎的组织块在吹打过程中游离出的细胞较好

胰酶浓度 0.05 我觉得就够了。我觉得你没注意这个问题。可能是用的浓度交大，试试低一点的浓度。

作者: cortex 时间: 2010-3-30 21:44

我觉得这个与你剪碎组织的大小有关。一般在37°消化，具体时间可以根据你消化的情况而定。一般一不出现大的团块为准。

作者: zhangdagou 时间: 2010-3-31 02:54

结合我自己的经验，我觉得楼上的几位取出的细胞比较少，我一般是一只老鼠的胚胎种植一瓶T75培养瓶的MEF，关键是剪碎，可以将胚胎放在1.5ml EP管里面剪碎，效果蛮好，楼上几位给出的消化时间比较短，这个是不合乎根据的，MEF细胞主要来自于鼠胚的皮肤，这个是很难消化的，0.25胰酶消化长则细胞死亡多，消化短则得到的细胞少，一般用肉眼判断，消化的时候发现皮肤变白，逐渐变糊糊状时候就可以了，这个时间一般在20min左右，还和胰酶活性有关，对于放久了的胰酶可以将时间变长点

作者: wxl87 时间: 2010-3-31 15:55

我们实验室都是消化5~10分钟，37度。然后多吹打

作者: iseeyou1210 时间: 2010-3-31 17:36

我们一般用多部消化的策略，先剪碎，然后用2ml的trypsin，消化3分钟，然后颠倒一下管子，然后2分钟，颠倒一下管子，然后一分钟，将上清细胞悬液转移到有DMEM+FSC的全培养基，然后重复2-3次同样的消化过程，然后离心，把所有的细胞放到T25中，一般第二天，铁壁的细胞大概count有8-12 million。
我说的从E13.5的embryo中提取MEF。

作者: ouyi2738 时间: 2010-3-31 22:07

我的经验感觉trypsin对MEF的损伤没有你说的那么严重。我们一般是10cmdish做（也有人用15cm的大盘），一个胚胎可以长满一盘。消化时间取决于组织块大小，组织快应该是剪得越小越好，37度消化，2分钟点到一次，组织块小的15min就可以全部消化成絮状。组织块大的我们最长消化过30-40min（0.25trypsin+1mMEDTA），仍然长得不错，我想是组织快大，表面的细胞损伤大死亡较多，但是里面的细胞量也是很多的，总之从未出现过全部死亡的现象。楼主可以试一下连组织块一起培养，有时组织块很多，我们就不过筛网，等贴壁后第一次传代的时候，用差速贴壁除掉组织快和杂细胞。

作者: zhangdagou 时间: 2010-4-1 04:15

楼上说的絮状是什么概念？可以具体描述一下好么？是消化成糊糊状？

作者: zpzp0312 时间: 2010-4-1 21:00

楼主操作有问题
即使更长时间的消化，也不会造成细胞全部死亡！
有必要优化一下操作方案

作者: ssuwhite 时间: 2010-4-2 16:44

初涉该领域，先学习下

作者: czzhaozhu 时间: 2010-4-7 16:02

我认为需要的消化时间取决于以下几个因素：1.胰酶的浓度：浓度大消化时间就得缩短；2.消化的温度：37度时时间比室温要短；3.组织块的大小。我们实验室的常规做法是用0.05%trypsin+0.53mMEDTA在37度消化约5-8分钟，每次加约5ml胰酶，组织块剪成1mm3大小就行，大概4-5次就能全部消化完。

作者: ppcl2 时间: 2010-4-8 06:52

这个不像消化时间过长，还是做得少，经验不足，消化即使30分钟也不应该有太大问题的，建议多看两个protocol，取长补短，再试试，这个本来是最简单的细胞分离实验。

作者: ppcl2 时间: 2010-4-8 06:54

你这个是忽悠人家，5分钟是显然不够的，一般15分钟上下。

作者: zhangdagou 时间: 2010-4-9 18:58

支持楼上的，根据我自己的经验，消化5分钟取得的细胞很少很少

作者: sniper 时间: 2010-4-9 22:15

1分钟多就好

作者: zhangdagou 时间: 2010-4-9 22:32

楼上的或许是无心的忽悠人家，一分钟，你的胰酶浓度多少呢？有这么厉害的？

作者: cony 时间: 2010-4-12 10:05

我们把一只老鼠的胚胎剪碎放在一起，胰酶37度消化30分钟，但第二天都没什么问题啊，还长得很密呢。我觉得你不只是消化时间的问题了。。。

作者: iamcyy1224 时间: 2010-4-17 21:28

0.05%的胰酶一个胚胎一毫升

作者: 周会 时间: 2010-4-19 20:00

我觉得8楼说的挺有道理，关键是粉碎，消化时间控制在15-20分钟，这个细胞还是很皮实的，胰酶最好是现配现用！

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