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标题: 关于PBMC复苏之后絮状物问题 [打印本页]

作者: nailute1985 时间: 2016-4-13 16:31 标题: 关于PBMC复苏之后絮状物问题

最近在做T细胞扩增实验时候，我D0的时候复苏了一管PBMC，培养到约D2的时候发现培养基中有白色的丝絮状物，镜下观察有大量的细胞被粘连在一起，吹散不开。感觉粘性很强。对培养基中的细胞染色，没有什么死细胞也。我用的是人的cord blood提的PBMC，冻存密度1*10的7，复苏之后接种密度1*10的6/ml，D0天细胞比较正常，D2天细胞就开始粘连在一起了，怀疑是不是有死亡的细胞释放的DNA将细胞缠绕在一起了？还有在D0天复苏之后的PBMC接种到6孔板中镜下观察并未发现类似于血小板或者红细胞之类的那种小黑点点，但是从D2天开始，小黑点点就出来了（不是污染，应该还是血小板或者红细胞之类的，或者是细胞碎片），请教各位有谁遇到过这种情况，怎么处理的？谢谢) r: j) r8 J, Q* c2 n; \
图中左下角的孔中可以明显的看到。
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刚接种时培养基黑点很少, L, n( T) m" E% Z7 C- o
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D2天开始出来) O, d8 V, O9 w9 w: ?" V+ S4 p" n$ Y
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作者: zhenghua20 时间: 2016-4-13 16:43

PBMC复苏确实是比较困难，一般活率很低，我们暂时也没找到什么好的解决办法。

作者: riverdtang 时间: 2016-4-13 16:50

就是一些细胞碎片，细胞长起的话过一下细胞筛来就好了

作者: nailute1985 时间: 2016-4-13 17:00

回复 riverdtang 的帖子2 N; R. w8 k- O9 b5 }. r/ W
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嗯，是这样，在PBMC分离完之后直接培养的话，也是会出现这种情况，但是那些应该是血小板或者是红细胞之类的，样子跟这个差不多。复苏之后出现的这些大概就是细胞碎片了吧？但是残留的血小板和红细胞去哪里了？难道是复苏之后洗涤掉了？

作者: nailute1985 时间: 2016-4-13 17:01

回复 zhenghua20 的帖子% U. l( v1 U& N& @6 o# e
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活率我们这还是可以的，主要看增殖倍数吧。。一般复苏之后前几天，细胞状态都不是很好，过几天挺过来了就行了吧？

作者: 我是传奇 时间: 2016-4-15 12:59

挑出来，好奇的话你可以再养，看看到底是什么。

作者: nailute1985 时间: 2016-4-15 13:18

回复我是传奇的帖子 Q! r- X# w, M, p- C7 A, ?
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死细胞释放的DNA，缠绕了细胞

作者: biluolinyu 时间: 2016-4-19 11:34

缠在一起的细胞，这种情况下细胞基本不会怎么增殖，大约10倍左右吧。PBMC冻存之后复苏活率其实还好，但是增殖倍数也就是冻存前的50%左右不好客服

作者: fenlichong 时间: 2016-4-20 11:25

首先，刚复苏的PBMC本身可能就有死细胞团，如果分离的白膜层不够纯，死细胞团可能会更多，最好用100um滤网过滤后再使用。其次，不知楼主T细胞扩增用的什么方法，如果是将PBMC用作feeder cell，需要将其进行辐照。

作者: nailute1985 时间: 2016-4-20 15:36

回复 fenlichong 的帖子
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嗯，我们的PBMC提完之后是直接冻存起来的，里面肯定会有些红细胞之类的。然后复苏之后我们也是直接加刺激因子刺激，那些单核或者红细胞，碎片啥的老板说就当作feeder去养，也不影响T细胞的扩增，但是我们没有用辐照。现在的问题是，在D8的时候我计数发现细胞不怎么增殖了，貌似已经到了平台期了，这才8天，一般的T细胞周期是2周左右，而且镜下观察，细胞形态分多样化，而真正T细胞那种体积大的细胞，容易抱团的细胞很少，不知道是不是PBMC复苏之后的原因。

作者: nailute1985 时间: 2016-4-20 15:37

回复 biluolinyu 的帖子" W+ P8 n3 ^9 c1 }) n6 u
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您说的增殖倍数是冻存之间的50% 也就才是1.5倍的增殖么？您有做过这方面的验证实验吗？

作者: why77yhw 时间: 2016-4-20 16:09

造成这样的原因，应该是血小板或者其他的死细胞释放物质导致细胞粘连。2 {9 A0 G# P: O" m0 j4 T& v6 V
遇到过类似的情况，不知道跟我的是否一样。按照我的经验，希望能有帮助，共同学习。我的情况是，细胞成片，或贴壁或悬浮，但镜下观察并非死细胞，而且这种情况是在添加完因子之后的第二天一早发现。
将上层悬浮细胞转移到新的孔内培养，这部分细胞充分吹打（稍微加点白蛋白），经常观察，适度吹打！原孔内残留的细胞正常培养，不吹打，任由它自己发展，经过约3天的培养这部分细胞或许会慢慢散开、悬浮（并不是每个样本都能这么顺利），如果它基本不生长，里面的细胞逐渐破碎，说明它并不是我们想要的T，放弃它没问题，留着它反倒影响正常细胞生长。这样做，或许会对细胞培养有所帮助！我的这种经验欠缺，希望能对你有帮助！

作者: why77yhw 时间: 2016-4-20 16:13

还有一个不太成熟的经验，装袋培养，这种情况会缓解

作者: biluolinyu 时间: 2016-4-20 16:21

回复 nailute1985 的帖子+ j# v8 p1 m- n# j2 E

不是啊，冻存之前，也就是直接培养的CIK的增殖倍数大约是二百倍以上啊。冻存后复苏的PBMC如果做得好的话扩增倍数基本也能达到百倍。
我之前做过类似的试验。确实实验过程中发现如果细胞复苏后有你图片中的那种情况后，细胞基本不会怎么增殖

作者: nailute1985 时间: 2016-4-20 17:18

回复 why77yhw 的帖子
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因为我们是小体系培养，转袋的话不方便。

作者: nailute1985 时间: 2016-4-20 17:20

回复 biluolinyu 的帖子
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对，还有，您说的PBMC扩增倍数百倍的话，是指的所有细胞数对吧？不是单纯的T细胞，因为现在我在养PBMC的，已经D8天了，T细胞那种形态的比较少，都是比T细胞小的细胞，如果算扩增倍数的话，这部分细胞需要算进去嘛？

作者: nailute1985 时间: 2016-4-20 17:22

回复 why77yhw 的帖子

我们培养体系就是用的白蛋白，按照您的方法，您把上层悬浮的细胞吸出去之后充分吹打的话，我觉得还是吹散不开，毕竟是DNA粘连在一起的。我的做法就是那种丝状的东西我就直接挑出来，虽然会损失细胞，但是后期会好很多。

作者: aochongyu 时间: 2016-4-21 14:22

前期冻存pbmc时可以裂解一下红细胞，去除后期一些可能生成的细胞碎片，孔板培养毕竟细胞量有限，细胞岁片多的话一定影响细胞增殖

作者: aochongyu 时间: 2016-4-21 14:23

这是多少孔板？24？' }9 B( W" Q9 O' B. p2 K

作者: biluolinyu 时间: 2016-4-21 14:51

回复 nailute1985 的帖子2 B) v+ \! K# c1 Q- t8 R( U& d

我直接用机器计的白细胞，所以应该都算进去了。培养十四天时，流式纯度都挺好的 CD3+也都是95以上

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