通过综合筛选策略获得催化性能增强的亮氨酸脱氢酶并用于L-叔亮氨酸的合成

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Applied Microbiology and Biotechnology:发表了“通过综合筛选策略获得催化性能增强的亮氨酸脱氢酶并用于L-叔亮氨酸的合成”的研究成果2 s% N- A- D4 Y' [
来源：江南大学 2021-06-14 18:12( X' B" z; B- N" b! [
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. t9 m- m4 _" ~: L) X近期，江南大学生物工程学院穆晓清团队在亮氨酸脱氢酶的定向进化中取得进展，研究成果“Enhanced catalytic efficiency and coenzyme affinity of leucine dehydrogenase by comprehensive screening strategy for L-tert-leucine synthesis”正式发表于applied Microbiology and Biotechnology(IF=3.53)。
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, c  B; D! C8 _% [1 e# p' KL-叔亮氨酸是合成抗癌和抗HIV蛋白酶抑制剂的重要手性中间体。由于其侧链叔丁基疏水性强的特点，它也被广泛用作不对称合成中有机催化剂的手性助剂。亮氨酸脱氢酶不对称催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸这个反应途径，具有原子利用率高，副产物少等特点因而在工业生产L-叔亮氨酸中被广泛应用。目前工业生产中，影响L-叔亮氨酸生产成本有两大因素，即：细胞添加量和辅酶添加量。因此获得催化效率高，辅酶亲和力高的工程亮氨酸脱氢酶将具有良好的工业应用前景。
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5 j- X! h  B; w% E0 v' |4 Q穆晓清团队在对亮氨酸脱氢酶的定向进化中使用了两种筛选策略。首先通过易错PCR寻找对亮氨酸脱氢酶催化效率有提升作用的关键残基，通过约3000株突变体筛选锁定了3个对催化效率起作用的关键点；然后在对三个关键点进行组合的过程中，运用了低辅酶浓度的筛选策略对迭代饱和突变文库进行了筛选，并获得了在低辅酶浓度条件下依然展现出高催化效率的突变组合。通过两步筛选，最终获得的突变组合E24V/E116V对底物和辅酶的亲和力分别提高了7.7倍和2.8倍，同时该突变株对底物的催化效率kcat/Km提高了5.4倍。在配合葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统的反应体系中，该突变体在低辅酶浓度的条件下展现出较高的催化效率。当辅酶浓度为0.05 mM时，E24V/E116V的催化效率相比于野生型提高了10倍。在高浓度底物的转化实验中，存在显着的底物抑制现象。为了解除底物抑制的影响，本研究采取了分批补料的策略，在75分钟内实现了0.57 M底物完全转化。最终TTN高达11400。(生物谷Bioon.com）  T8 b" F" C+ {" @* C) Q* H
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